相信大家對于CAR-T細胞療法已經不陌生了，它對一些血液惡性良性腫瘤有着極其顯著的療效，然而CAR-T細胞療法在實體瘤治療中收效甚微，甚至在血液惡性良性腫瘤中除了急性B細胞白血病之外，大部分其他類型的血液惡性良性腫瘤患者由于體内CAR-T細胞失活并沒有出現持續性緩解[1]。
于是許多科學家們便緻力于尋找會使T細胞失活的基因，及其涉及的生物學機制。但是有研究者反其道而行之。
近日，由紐約大學Peter Smibert和Neville E. Sanjana領銜的研究團隊在《自然》雜志上發表重要研究成果[2]。
他們利用OverCITE-seq這一單細胞水準的高通量技術手段，測試了大約12000個人類基因組開放閱讀框（ORF）的過表達，對T細胞的增殖以及功能的增強作用。他們找到了能增加T細胞活性和增殖能力的ORF，并證明将它們用于改造現有CAR-T細胞的嵌合抗原受體，能增強CAR-T細胞的抗癌能力。
論文截圖
作為一種用于治療癌症的“活”藥物，已經有6款不同的CAR-T療法被FDA準許上市[3]，并且在血液惡性良性腫瘤治療中取得了非常顯著的成效，有患者在接受治療十年後都沒有複發，甚至體内仍然有CAR-T細胞存在[4]。
即便如此，也還是有許多血液惡性良性腫瘤患者治療後并沒有達到持續性緩解，其中最主要的原因就是回輸體内的CAR-T細胞失活，進入耗竭狀态[1]。
為了解決這個問題，許多科學家便轉而去研究導緻T細胞失活的生物學機制。例如通過CRISPR技術敲除基因組上的所有基因，來确定是哪些基因起了主導作用[5]。
由于基因數量太多，這種方式面臨較大的挑戰性，并且由于CRISPR系統自身的特性，可能會使得編輯後的T細胞受到患者自身免疫系統排斥[6]。
是以Peter Smibert和Neville E. Sanjana團隊提出了一個完全不同的解決方案——既然CAR-T細胞在體内容易失活，那麼就給它們加上能增強增殖能力和抗癌活性的基因，使得CAR-T細胞對癌細胞來說更具“侵略性”。
為了避免加入的基因在T細胞内無法正常表達，研究人員用慢病毒作為載體将大約12000個基因的全長序列，分别轉導入三個健康捐獻者的預刺激CD4+以及CD8+T細胞，這些基因平均每個帶有6個用于後續識别的“條形碼”（Barcode）。
将這些細胞體外培養14天後，對它們進行熒光标記，之後再次刺激使得T細胞增殖，随後通過比較刺激前後基因Barcode數量的變化，可以得到這些基因對T細胞增殖的影響。
實驗設計原理
在增強T細胞擴增能力排名靠前的基因（Top-ranked）中，有許多是已知能參與免疫過程的基因，包括MAPK3、BATF、IL12B以及IL23A等等[7]。這其中促進作用最大的基因是LTBR（編碼淋巴毒素β受體），LTBR在基質和骨髓細胞中廣泛表達，但幾乎不在淋巴細胞中表達。
接着研究人員便進一步探究了33個Top-ranked基因對T細胞其他功能的影響，他們這次選擇了一個缺少細胞内結構域的神經生長因子受體（tNGFR）作為對照，将tNGFR和33個基因分别利用載體轉導進CD4+和CD8+T細胞中。
在經過和前面一樣的實驗流程之後，研究人員不僅比較了實驗組和對照組之間T細胞擴增的差異，還同時比較了T細胞分泌細胞因子能力，以及表面活性标志物表達差異。
他們發現在CD4+和CD8+T細胞中，Top-ranked基因與增殖能力是高度相關的（r=0.61，p=0.002），并且其中大部分基因都會使得T細胞在激活後CD25和CD154的表達增加。
除此之外還有一些基因能增強T細胞分泌細胞因子的能力，最顯著的基因仍然是LTBR，它能使得T細胞分泌的細胞因子增加5倍之多。
能促進T細胞分泌細胞因子的基因中，LTBR最強
到這裡，研究人員已經證明了Top-ranked基因能夠促進T細胞增殖、表面活性标志物表達以及細胞因子分泌，于是他們想知道這些基因發揮作用的具體機制。
Peter Smibert和Neville E. Sanjana團隊開發了OverCITF-seq測序平台，對轉導進T細胞的基因ORF表達量進行單細胞水準上的量化。這項技術的原理是設計一個針對基因ORF Barcode的RNA引物，來引導ORF的mRNA進行反轉錄，使得在RNA測序過程中，ORF能組成一個獨立的cDNA文庫，細胞中其他的基因則組成另一個cDNA文庫。
OverCITE的技術原理
利用OverCITE-seq技術，研究人員對來自同一個健康捐獻者且分别轉導了30個基因ORF的CD8+T細胞進行了測序，這些細胞一部分被按照之前的實驗流程操作——經過了再次刺激過程，一部分則在轉導後并沒有再刺激，處于“休眠狀态”。
将這些CD8+T細胞根據基因表達譜進行無監督聚類後，他們發現激活和未激活的T細胞可以很清晰地分成兩類，同時兩大類又可以分成10小類。其中一些種類是和特定的T細胞狀态或功能相關的，表明同一類T細胞具有類似的狀态或功能，例如類别1和細胞周期有關，類别10與T細胞的活化和增殖有關。
将T細胞根據基因表達譜進行聚類
然後研究人員分析了10種T細胞中轉導的ORF富集情況，以确定ORF對細胞轉錄組的影響，發現在類别1中CDK1和CLIC1顯著富集，類别10中則是LTBR顯著富集。
結合上述不同種類T細胞與特定狀态和功能的關系，這進一步表明LTBR通過重塑細胞轉錄組，進而實作既能促進T細胞增殖，又可以增強T細胞活性以及分泌細胞因子的能力。
既然LTBR可以憑一己之力重塑T細胞的轉錄組，那就很值得研究一下它是怎麼做到的。
研究人員利用bulk-seq比較了分别轉導LTBR和tNGFR的T細胞（下文稱LTBR細胞和tNGFR細胞）之間的基因表達譜，發現LTBR細胞不僅上調MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ相關基因，還表達由CD74編碼的MHC-Ⅱ恒定鍊，CD74已經被證明在B細胞中能夠激活抗凋亡的NF-kB通路，同時LTBR細胞還上調BATF3，這是一個能促進CD8+T細胞生存的基因。
在後續的實驗中，研究人員也發現與tNGFR細胞相比，LTBR細胞有更強的抗激活所誘導的細胞凋亡能力，以及在受到持續刺激的情況下保有更大的功能性，不容易進入耗竭狀态。
與tNGFR細胞相比，激活後的LTBR細胞有更強的抗凋亡能力（上）；
LTBR在受到多次刺激後PD-1水準仍然較低（下）
說了這麼多LTBR細胞的特征，再回到LTBR本身，它在骨髓細胞中表達，它涉及的信号通路是由LTA和LTB組成的三聚體或者LIGHT（由TNFSF14編碼）激活的，而LTA、LTB以及LIGHT均由活化T細胞表達。
于是研究人員探究了激活後的LTBR細胞是否會受來自外部的上述三種分子的影響，結果發現LTBR細胞并不受影響，這表明LTBR的高表達盡管對T細胞有增強功能促進增殖的作用，但并不會驅動本身的活化。這也消除了一個臨床應用上的安全問題——LTBR細胞不會因為外部環境而失去特異性識别惡性良性腫瘤抗原的功能。
随後，為了找出LTBR的關鍵結構域，研究人員在LTBR序列中引入突變。總體上LTBR的N端比C端對于缺失突變更耐受，缺失393-435的殘基對LTBR的功能幾乎沒有影響，而缺失377-435的殘基則會讓LTBR完全失去功能。
解析LTBR調控機制的探索仍在繼續，研究人員利用ATAC-seq分析了LTBR細胞和tNGFR細胞的表觀組學差異，發現NF-kB p65（RELA）是LTBR細胞中最富集的轉錄因子。同時他們觀察到在受到刺激後LTBR細胞中NF-kB信号通路的p65（RELA）會快速磷酸化，而相應的抑制劑磷酸化水準也會升高，兩者同時增強了NF-kB通路的活性，以及通路所涉及基因的轉錄活性。
除了經典的NF-kB通路，研究人員還發現了非經典NF-kB通路的p52（RELB）同樣在LTBR細胞中富集，但是他們通過分别敲除兩個信号通路相關基因結合bulk-seq分析發現，隻有RELA的缺失會造成LTBR涉及通路的核心基因下調，而RELB的缺失并沒有顯著影響，表明LTBR極有可能是通過經典的NF-kB通路發揮作用的。
RELA的缺失會造成LTBR細胞核心基因下調，而RELB的缺失則不會
由于前面的實驗中LTBR細胞和tNGFR細胞都是經過CD3/CD28的刺激活化，是沒有特異性的激活過程，研究人員便想知道在特異性抗原刺激下LTBR細胞是否會出現和之前一樣效果。
他們将一些Top-ranked基因與兩款FDA準許的CAR-T療法的CARs建構共表達載體對T細胞進行改造，這兩種CARs都特異性靶向CD19，但一種CAR使用CD28作為共刺激域而另一種則使用4-1BB作為共刺激域。
在将改造後的CAR-T細胞與Nalm6（CD19+淋巴瘤細胞）共同培養之後，研究人員發現幾乎所有的Top-ranked基因都促進了T細胞CD25的表達，以及抗原特異性細胞因子分泌。
盡管分泌細胞因子是T細胞抗惡性良性腫瘤活性的重要名額，但還有一個關鍵部分是對惡性良性腫瘤細胞的直接殺傷作用，也就是細胞毒性。與4-1BB CAR-T細胞相比Top-ranked基因對CD28 CAR-T細胞毒性的增強作用更大。并且表達LTBR的CAR-T細胞更不容易進入耗竭狀态。
Top-ranked基因對CD28 CAR-T細胞的增強作用更大（左）；表達LTBR的CAR-T細胞更能保持功能
考慮到上述所有實驗的T細胞均來自于健康人，這些T細胞易于改造且不會在培養過程中失活，但事實上CAR-T細胞療法改造的是惡性良性腫瘤患者體内的T細胞。
是以研究人員采集了來自彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的外周血，将LTBR和CARs轉導進單核細胞，在與CD19+靶細胞共同培養後，他們發現LTBR CAR-T細胞因子分泌增加，和在健康人T細胞中觀察到的現象一緻。
值得一提的是，研究人員還嘗試了在一種“非主流”T細胞——γδT細胞中進行上述改造實驗，最後的結果仍然是改造後的T細胞分泌細胞因子的能力增強。
這項研究從“gain of function（獲得功能）”的角度出發，在12000個基因中找到了能使得現有CAR-T細胞功能增強，而又不喪失特異性的基因，其中最顯著的基因LTBR甚至既能增強T細胞的增殖能力，又可以增加T細胞表面活性标志物的表達以及細胞因子分泌。
來自英國卡迪夫大學細胞免疫治療領域的專家Andrew Sewell博士評價道[8]：“在全基因組範圍内尋找能讓T細胞獲得功能的基因，有着巨大的潛力來使得免疫治療更加成功，特别是在目前CAR-T療法收效甚微的實體瘤治療領域”。
參考文獻：
[1] Fraietta JA, Lacey SF, Orlando EJ, et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia [published correction appears in Nat Med. 2021 Mar;27(3):561]. Nat Med. 2018;24(5):563-571. doi:10.1038/s41591-018-0010-1
[3] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells
[5] Shifrut E, Carnevale J, Tobin V, et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018;175(7):1958-1971.e15. doi:10.1016/j.cell.2018.10.024
[8] https://www.nygenome.org/programming-the-immune-system-to-supercharge-cancer-cell-therapies/
責任編輯丨BioTalker