相信大家对于CAR-T细胞疗法已经不陌生了，它对一些血液肿瘤有着极其显著的疗效，然而CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中收效甚微，甚至在血液肿瘤中除了急性B细胞白血病之外，大部分其他类型的血液肿瘤患者由于体内CAR-T细胞失活并没有出现持续性缓解[1]。
于是许多科学家们便致力于寻找会使T细胞失活的基因，及其涉及的生物学机制。但是有研究者反其道而行之。
近日，由纽约大学Peter Smibert和Neville E. Sanjana领衔的研究团队在《自然》杂志上发表重要研究成果[2]。
他们利用OverCITE-seq这一单细胞水平的高通量技术手段，测试了大约12000个人类基因组开放阅读框（ORF）的过表达，对T细胞的增殖以及功能的增强作用。他们找到了能增加T细胞活性和增殖能力的ORF，并证实将它们用于改造现有CAR-T细胞的嵌合抗原受体，能增强CAR-T细胞的抗癌能力。
论文截图
作为一种用于治疗癌症的“活”药物，已经有6款不同的CAR-T疗法被FDA批准上市[3]，并且在血液肿瘤治疗中取得了非常显著的成效，有患者在接受治疗十年后都没有复发，甚至体内仍然有CAR-T细胞存在[4]。
即便如此，也还是有许多血液肿瘤患者治疗后并没有达到持续性缓解，其中最主要的原因就是回输体内的CAR-T细胞失活，进入耗竭状态[1]。
为了解决这个问题，许多科学家便转而去研究导致T细胞失活的生物学机制。例如通过CRISPR技术敲除基因组上的所有基因，来确定是哪些基因起了主导作用[5]。
由于基因数量太多，这种方式面临较大的挑战性，并且由于CRISPR系统自身的特性，可能会使得编辑后的T细胞受到患者自身免疫系统排斥[6]。
因此Peter Smibert和Neville E. Sanjana团队提出了一个完全不同的解决方案——既然CAR-T细胞在体内容易失活，那么就给它们加上能增强增殖能力和抗癌活性的基因，使得CAR-T细胞对癌细胞来说更具“侵略性”。
为了避免加入的基因在T细胞内无法正常表达，研究人员用慢病毒作为载体将大约12000个基因的全长序列，分别转导入三个健康捐献者的预刺激CD4+以及CD8+T细胞，这些基因平均每个带有6个用于后续识别的“条形码”（Barcode）。
将这些细胞体外培养14天后，对它们进行荧光标记，之后再次刺激使得T细胞增殖，随后通过比较刺激前后基因Barcode数量的变化，可以得到这些基因对T细胞增殖的影响。
实验设计原理
在增强T细胞扩增能力排名靠前的基因（Top-ranked）中，有许多是已知能参与免疫过程的基因，包括MAPK3、BATF、IL12B以及IL23A等等[7]。这其中促进作用最大的基因是LTBR（编码淋巴毒素β受体），LTBR在基质和骨髓细胞中广泛表达，但几乎不在淋巴细胞中表达。
接着研究人员便进一步探究了33个Top-ranked基因对T细胞其他功能的影响，他们这次选择了一个缺少细胞内结构域的神经生长因子受体（tNGFR）作为对照，将tNGFR和33个基因分别利用载体转导进CD4+和CD8+T细胞中。
在经过和前面一样的实验流程之后，研究人员不仅比较了实验组和对照组之间T细胞扩增的差异，还同时比较了T细胞分泌细胞因子能力，以及表面活性标志物表达差异。
他们发现在CD4+和CD8+T细胞中，Top-ranked基因与增殖能力是高度相关的（r=0.61，p=0.002），并且其中大部分基因都会使得T细胞在激活后CD25和CD154的表达增加。
除此之外还有一些基因能增强T细胞分泌细胞因子的能力，最显著的基因仍然是LTBR，它能使得T细胞分泌的细胞因子增加5倍之多。
能促进T细胞分泌细胞因子的基因中，LTBR最强
到这里，研究人员已经证明了Top-ranked基因能够促进T细胞增殖、表面活性标志物表达以及细胞因子分泌，于是他们想知道这些基因发挥作用的具体机制。
Peter Smibert和Neville E. Sanjana团队开发了OverCITF-seq测序平台，对转导进T细胞的基因ORF表达量进行单细胞水平上的量化。这项技术的原理是设计一个针对基因ORF Barcode的RNA引物，来引导ORF的mRNA进行反转录，使得在RNA测序过程中，ORF能组成一个独立的cDNA文库，细胞中其他的基因则组成另一个cDNA文库。
OverCITE的技术原理
利用OverCITE-seq技术，研究人员对来自同一个健康捐献者且分别转导了30个基因ORF的CD8+T细胞进行了测序，这些细胞一部分被按照之前的实验流程操作——经过了再次刺激过程，一部分则在转导后并没有再刺激，处于“休眠状态”。
将这些CD8+T细胞根据基因表达谱进行无监督聚类后，他们发现激活和未激活的T细胞可以很清晰地分成两类，同时两大类又可以分成10小类。其中一些种类是和特定的T细胞状态或功能相关的，表明同一类T细胞具有类似的状态或功能，例如类别1和细胞周期有关，类别10与T细胞的活化和增殖有关。
将T细胞根据基因表达谱进行聚类
然后研究人员分析了10种T细胞中转导的ORF富集情况，以确定ORF对细胞转录组的影响，发现在类别1中CDK1和CLIC1显著富集，类别10中则是LTBR显著富集。
结合上述不同种类T细胞与特定状态和功能的关系，这进一步表明LTBR通过重塑细胞转录组，从而实现既能促进T细胞增殖，又可以增强T细胞活性以及分泌细胞因子的能力。
既然LTBR可以凭一己之力重塑T细胞的转录组，那就很值得研究一下它是怎么做到的。
研究人员利用bulk-seq比较了分别转导LTBR和tNGFR的T细胞（下文称LTBR细胞和tNGFR细胞）之间的基因表达谱，发现LTBR细胞不仅上调MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ相关基因，还表达由CD74编码的MHC-Ⅱ恒定链，CD74已经被证明在B细胞中能够激活抗凋亡的NF-kB通路，同时LTBR细胞还上调BATF3，这是一个能促进CD8+T细胞生存的基因。
在后续的实验中，研究人员也发现与tNGFR细胞相比，LTBR细胞有更强的抗激活所诱导的细胞凋亡能力，以及在受到持续刺激的情况下保有更大的功能性，不容易进入耗竭状态。
与tNGFR细胞相比，激活后的LTBR细胞有更强的抗凋亡能力（上）；
LTBR在受到多次刺激后PD-1水平仍然较低（下）
说了这么多LTBR细胞的特征，再回到LTBR本身，它在骨髓细胞中表达，它涉及的信号通路是由LTA和LTB组成的三聚体或者LIGHT（由TNFSF14编码）激活的，而LTA、LTB以及LIGHT均由活化T细胞表达。
于是研究人员探究了激活后的LTBR细胞是否会受来自外部的上述三种分子的影响，结果发现LTBR细胞并不受影响，这表明LTBR的高表达尽管对T细胞有增强功能促进增殖的作用，但并不会驱动本身的活化。这也消除了一个临床应用上的安全问题——LTBR细胞不会因为外部环境而失去特异性识别肿瘤抗原的功能。
随后，为了找出LTBR的关键结构域，研究人员在LTBR序列中引入突变。总体上LTBR的N端比C端对于缺失突变更耐受，缺失393-435的残基对LTBR的功能几乎没有影响，而缺失377-435的残基则会让LTBR完全失去功能。
解析LTBR调控机制的探索仍在继续，研究人员利用ATAC-seq分析了LTBR细胞和tNGFR细胞的表观组学差异，发现NF-kB p65（RELA）是LTBR细胞中最富集的转录因子。同时他们观察到在受到刺激后LTBR细胞中NF-kB信号通路的p65（RELA）会快速磷酸化，而相应的抑制剂磷酸化水平也会升高，两者同时增强了NF-kB通路的活性，以及通路所涉及基因的转录活性。
除了经典的NF-kB通路，研究人员还发现了非经典NF-kB通路的p52（RELB）同样在LTBR细胞中富集，但是他们通过分别敲除两个信号通路相关基因结合bulk-seq分析发现，只有RELA的缺失会造成LTBR涉及通路的核心基因下调，而RELB的缺失并没有显著影响，表明LTBR极有可能是通过经典的NF-kB通路发挥作用的。
RELA的缺失会造成LTBR细胞核心基因下调，而RELB的缺失则不会
由于前面的实验中LTBR细胞和tNGFR细胞都是经过CD3/CD28的刺激活化，是没有特异性的激活过程，研究人员便想知道在特异性抗原刺激下LTBR细胞是否会出现和之前一样效果。
他们将一些Top-ranked基因与两款FDA批准的CAR-T疗法的CARs构建共表达载体对T细胞进行改造，这两种CARs都特异性靶向CD19，但一种CAR使用CD28作为共刺激域而另一种则使用4-1BB作为共刺激域。
在将改造后的CAR-T细胞与Nalm6（CD19+淋巴瘤细胞）共同培养之后，研究人员发现几乎所有的Top-ranked基因都促进了T细胞CD25的表达，以及抗原特异性细胞因子分泌。
尽管分泌细胞因子是T细胞抗肿瘤活性的重要指标，但还有一个关键部分是对肿瘤细胞的直接杀伤作用，也就是细胞毒性。与4-1BB CAR-T细胞相比Top-ranked基因对CD28 CAR-T细胞毒性的增强作用更大。并且表达LTBR的CAR-T细胞更不容易进入耗竭状态。
Top-ranked基因对CD28 CAR-T细胞的增强作用更大（左）；表达LTBR的CAR-T细胞更能保持功能
考虑到上述所有实验的T细胞均来自于健康人，这些T细胞易于改造且不会在培养过程中失活，但事实上CAR-T细胞疗法改造的是肿瘤患者体内的T细胞。
因此研究人员采集了来自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血，将LTBR和CARs转导进单核细胞，在与CD19+靶细胞共同培养后，他们发现LTBR CAR-T细胞因子分泌增加，和在健康人T细胞中观察到的现象一致。
值得一提的是，研究人员还尝试了在一种“非主流”T细胞——γδT细胞中进行上述改造实验，最后的结果仍然是改造后的T细胞分泌细胞因子的能力增强。
这项研究从“gain of function（获得功能）”的角度出发，在12000个基因中找到了能使得现有CAR-T细胞功能增强，而又不丧失特异性的基因，其中最显著的基因LTBR甚至既能增强T细胞的增殖能力，又可以增加T细胞表面活性标志物的表达以及细胞因子分泌。
来自英国卡迪夫大学细胞免疫治疗领域的专家Andrew Sewell博士评价道[8]：“在全基因组范围内寻找能让T细胞获得功能的基因，有着巨大的潜力来使得免疫治疗更加成功，特别是在目前CAR-T疗法收效甚微的实体瘤治疗领域”。
参考文献：
[1] Fraietta JA, Lacey SF, Orlando EJ, et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia [published correction appears in Nat Med. 2021 Mar;27(3):561]. Nat Med. 2018;24(5):563-571. doi:10.1038/s41591-018-0010-1
[3] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells
[5] Shifrut E, Carnevale J, Tobin V, et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018;175(7):1958-1971.e15. doi:10.1016/j.cell.2018.10.024
[8] https://www.nygenome.org/programming-the-immune-system-to-supercharge-cancer-cell-therapies/
责任编辑丨BioTalker