不同于“殺敵一千，自損八百”的化療，癌基因靶向治療因精準作用于緻癌靶點而被稱為“生物飛彈”。
近年來，多種靶向治療藥物已成功應用于臨床，然而，晚期惡性良性腫瘤患者實際獲益并不理想，其中一個重要原因就是：耐藥。而我們對靶向治療獲得性耐藥的發生機制知之甚少。
有研究發現，在靶向治療中存活下來的殘留癌細胞，及随後發生的DNA損傷修複是惡性良性腫瘤細胞産生耐藥性的重要原因[1]。是以，探尋靶向治療誘導的DNA損傷修複相關分子，明确惡性良性腫瘤耐藥性的發生機制，對于靶向藥物的研發和臨床方案的選擇有着至關重要的作用。
近日，美國杜克大學Kris C. Wood博士及其團隊研究發現，靶向治療後存活下來的惡性良性腫瘤細胞中，存在DNA雙鍊斷裂（DSB）和DNA雙鍊斷裂修複，這一修複過程依賴于共濟失調毛細血管擴張突變（ATM）酶。
他們還發現，靶向治療藥物與ATM抑制劑聯合使用，可根除體外細胞株和動物模型中存活的殘餘惡性良性腫瘤細胞，進而産生更持久的治療反應[2]。
這一研究成果為臨床研發ATM抑制劑與現有靶向治療方案的整合奠定了理論基礎，相關研究成果近期發表在著名期刊《科學·轉化醫學》（Science Translational Medicine）上。
論文首頁
接下來，我們看看這項研究是如何開展的。
首先，為了研究靶向治療是否會激活DNA損傷應答信号通路（DDR），研究團隊使用了一組對同源靶向治療敏感的惡性良性腫瘤細胞株：表皮生長因子受體（EGFR）突變型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株（PC9、HCC827），間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排型NSCLC細胞株（H3122），BRAF基因突變型黑色素瘤細胞株（A375），FLT3基因突變型急性髓系白血病（AML）細胞株（MOLM13），KRAS基因突變型胰腺癌細胞株（MIA PaCa-2）和NSCLC細胞株（A549）。
在用不同劑量的同源靶向治療藥物處理上述細胞株24小時後，他們發現S1981位點被磷酸化的ATM（p-ATM）和γH2AX表達明顯增加。需要指出的是，ATM S1981位點磷酸化是激活下遊DNA損傷應答信号通路所必需的位點，H2AX（組蛋白H2A家族成員X）磷酸化産生的γH2AX是DNA雙鍊斷裂的生物标志物。
接下來的細胞克隆形成實驗表明，在不影響細胞活力的藥物劑量下，仍然觀察到γH2AX表達明顯增加，這一結論在三種吉非替尼（Gefitinib）耐藥EGFR突變型NSCLC細胞株（PC9R、GR4、WZR12）中得到了進一步驗證；同時，在接受靶向藥物處理的PC9和A549細胞中觀察到膜聯蛋白V染色（用于檢測細胞凋亡）為陰性。
最後，中性彗星試驗（在單細胞水準檢測DNA損傷的技術）發現，PC9和A549細胞靶向藥物處理24小時後檢測到DNA雙鍊斷裂的存在，表明觀察到的ATM激活是由于DNA損傷所緻。
以上結果表明，在靶向治療中存活的惡性良性腫瘤細胞會出現DNA雙鍊斷裂和随後的ATM激活。
靶向藥物處理的惡性良性腫瘤細胞中DNA損傷應答信号通路被激活
那麼，ATM又是如何被激活的呢？我們接着往下看。
首先，PC9和HCC827細胞用吉非替尼（EGFR阻斷劑）處理24小時後，觀察到ATM及其底物檢查點激酶2（Chk2）T68位點磷酸化表達增加；随後，研究人員分别用ATM激酶抑制劑（AZD0156）單獨或與吉非替尼聯合使用處理PC9細胞，發現AZD0156和吉非替尼聯合使用可消除γH2AX的表達和DNA雙鍊斷裂修複途徑的激活。
在接下來的實驗中，研究人員發現，随着吉非替尼使用劑量和處理時間的增加，p-ATM和γH2AX表達也逐漸增加，同時啟動者半胱天冬酶9（initiator caspase 9）和執行者caspase 3均被切割。
最近的一項研究表明，内源性途徑半胱天冬酶的激活可導緻DNA雙鍊斷裂的形成和随後的ATM激活[3]。是以，研究人員假設Bcl-2抗凋亡家族成員BIM和BAK/BAX激活下遊的半胱天冬酶，以及由此産生的線粒體外膜通透性（MOMP）增加，可能是DNA雙鍊斷裂以及ATM激活的原因。
為了驗證這一假設，他們在PC9細胞中分别敲除BIM和敲降BAX的表達，發現BIM和BAX低表達可消除靶向治療誘導的ATM和γH2AX的激活。為了進一步驗證這一假設，研究人員單獨使用泛半胱天冬酶抑制劑（Q-VD-OPh）或與吉非替尼聯合使用處理PC9細胞，發現兩者聯合使用可消除僅使用吉非替尼處理時觀察到的ATM激活。
在PC9細胞中同時敲除caspase 3和7，同樣可以消除吉非替尼處理的PC9細胞中ATM和γH2AX的激活。半胱天冬蛋白酶激活的脫氧核糖核酸酶（CAD）是一種由caspase 3和7激活的介導DNA雙鍊斷裂的關鍵酶，在用吉非替尼處理的PC9細胞中脫氧核糖核酸酶表達如何呢？
結果顯示，脫氧核糖核酸酶表達相對不變，但是胱天蛋白酶激活的脫氧核糖核酸酶抑制因子（ICAD）的表達顯著降低；研究人員進一步在PC9細胞中敲除脫氧核糖核酸酶表達，發現吉非替尼處理的PC9細胞中未觀察到γH2AX的激活，但仍然觀察到caspase 3被切割以及脫氧核糖核酸酶抑制因子的丢失。
以上結果表明，脫氧核糖核酸酶抑制因子的低表達導緻脫氧核糖核酸酶激活，并随之誘導了DNA雙鍊斷裂和ATM的激活并且caspase的激活和脫氧核糖核酸酶抑制因子的缺失在脫氧核糖核酸酶激活上遊起作用。
EGFR抑制劑誘導ATM信号通路激活
上述結果表明，在靶向治療中存活的細胞可能需要ATM激活來修複靶向治療暴露引起的DNA雙鍊斷裂。那麼ATM抑制劑是否可以改善靶向治療反應強度和持續時間呢？
首先，前面的實驗已證明AZD0156可以阻斷吉非替尼誘導的ATM激活，随後研究人員單獨使用AZD0156或與吉非替尼聯合處理PC9、PC9R、GR4細胞發現，AZD0156可以同時增加對靶向藥物敏感細胞株（PC9）和對靶向藥物耐藥細胞株（PC9R、GR4）對吉非替尼的敏感性。
這說明EGFR抑制劑治療後殘留的惡性良性腫瘤細胞，對EGFR抑制劑和ATM抑制劑聯合使用仍然敏感，這種聯合治療方案可以清除在EGFR抑制劑單一治療後存活的惡性良性腫瘤細胞。接下來，研究團隊對這一結論進行了進一步的驗證。
在長期定性進展時間（TTP）分析中觀察到AZD0156對細胞生長的影響很小，而吉非替尼單藥治療在大約40天左右導緻惡性良性腫瘤細胞耐藥性增加，而吉非替尼和AZD0156聯合治療可有效清除殘留惡性良性腫瘤細胞，進而避免耐藥惡性良性腫瘤細胞的生長。
最後，研究團隊評估了脫氧核糖核酸酶在EGFR抑制劑和ATM抑制劑聯合使用中對細胞反應的影響。研究發現，在PC9和GR4細胞中敲除脫氧核糖核酸酶的表達後，可以逆轉聯合治療對惡性良性腫瘤細胞生長抑制作用。接下來，抑制ATM的表達後，發現ATM的缺失消除了吉非替尼誘導的γH2AX的激活，表明AZD0156通過靶向ATM抑制發揮作用。
總之，這些結果表明，在EGFR抑制劑治療後存活的惡性良性腫瘤細胞中，脫氧核糖核酸酶介導的DNA雙鍊斷裂形成對ATM具有合成依賴性，ATM是解決這種DNA損傷的關鍵激酶。是以，EGFR抑制劑和ATM抑制劑聯合使用，可清除在EGFR抑制劑單一療法下存活的惡性良性腫瘤細胞，進而抑制耐藥性惡性良性腫瘤細胞的生長。
機制示意圖
體外細胞實驗已證明，EGFR抑制劑和ATM抑制劑聯合使用可抑制耐藥性惡性良性腫瘤細胞的生長，那麼，這一治療組合是否會阻止體内惡性良性腫瘤的生長呢？接下來，研究團隊進行了體内異種移植實驗，我們一起看看結果如何。
研究發現，單獨使用ATM抑制劑對惡性良性腫瘤生長幾乎沒有影響，EGFR抑制劑在惡性良性腫瘤産生耐藥性之前可抑制惡性良性腫瘤的生長，ATM抑制劑和EGFR抑制劑聯合治療的小鼠在整個研究期間顯示出持續的惡性良性腫瘤消退。
随後，研究團隊使用從肺癌患者惡性良性腫瘤組織中提取的三種細胞模型，MGH134（來自EGFR突變NSCLC患者且對一線厄洛替尼治療産生耐藥）、MGH1109（來自EGFR突變NSCLC初治患者）、MGH006（來自EML4-ALK變體1突變NSCLC初治患者）進行了進一步驗證。
結果顯示，ATM抑制劑可以抑制在靶向治療中耐藥惡性良性腫瘤的增長；與這一發現一緻，在MGH134異種移植小鼠中，奧希替尼治療産生了最初的生長抑制，随後惡性良性腫瘤進展，而奧希替尼與AZD0156的聯合治療産生了持續的惡性良性腫瘤消退。
靶向治療在小鼠異種移植模型中誘導ATM激活
研究最後，為了探索這些實驗結果與臨床可能存在的相關性，研究團隊分析了接受EGFR抑制劑治療的患者的惡性良性腫瘤組織中ATM激活情況。
首先，研究人員對5名EGFR突變NSCLC患者惡性良性腫瘤組織進行了免疫組織化學（IHC）染色，結果顯示，與接受EGFR抑制劑厄洛替尼治療前相比，治療期間惡性良性腫瘤組織中p-ATM表達明顯增加；進一步對所有患者惡性良性腫瘤樣本進行綜合分析發現，在接受厄洛替尼治療的進展性患者惡性良性腫瘤組織中p-ATM表達顯著增加。
接下來，研究人員分析了Sloan-Kettering可操作癌症靶點（MSK-IMPACT）臨床測序隊列資料庫中11名接受一線厄洛替尼治療的患者臨床進展時間資料，這11名患者同時發生了EGFR突變/厄洛替尼緻敏突變和ATM突變。
分析結果顯示，與沒有ATM突變的EGFR突變NSCLC患者相比，伴有ATM功能缺失突變的EGFR突變NSCLC患者的無進展生存期延長。出現ATM功能喪失突變的惡性良性腫瘤患者中，厄洛替尼治療的疾病進展時間（TTP）為17.8 ± 10.9個月，而在那些可能存在非功能性ATM突變的惡性良性腫瘤患者中，TTP為9.0± 1.9個月；這一結果，與未經選擇的EGFR突變NSCLC患者接受一線厄洛替尼治療的多個研究中觀察到的8到12個月的臨床進展時間一緻[4]。
以上這些資料表明，ATM激活發生在EGFR抑制劑治療後存活的惡性良性腫瘤細胞中，可能起到惡性良性腫瘤保護作用。
靶向治療在患者惡性良性腫瘤組織中誘導ATM激活
總的來說，這個研究探索了靶向治療産生耐藥性的分子機制，并通過體内外實驗進一步驗證了ATM抑制劑和靶向藥物聯合治療對耐藥惡性良性腫瘤的清除效果，最後回歸于臨床，檢測了NSCLC患者在靶向前後惡性良性腫瘤組織中的表達情況，以及ATM功能缺失性突變對靶向藥物療效的影響。
這項研究為臨床研發ATM抑制劑與現有靶向治療方案的整合，以及臨床試驗設計奠定了理論基礎，也為臨床提供了新的診療思路。
參考文獻
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2.Ali M, Lu M, Ang HX, et al. Small-molecule targeted therapies induce dependence on DNA double-strand break repair in residual tumor cells. Sci Transl Med. 2022;14(638):eabc7480. doi:10.1126/scitranslmed.abc7480
3.Liu X, Li F, Huang Q, et al. Self-inflicted DNA double-strand breaks sustain tumorigenicity and stemness of cancer cells. Cell Res. 2017;27(6):764-783. doi:10.1038/cr.2017.41
4.Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 2013;19(8):2240-2247. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2246
責任編輯丨BioTalker