胃腸道惡性良性腫瘤（GIC，包括胃癌、胰腺癌、結直腸癌）和神經内分泌惡性良性腫瘤（NET）一旦發生轉移治療方法有限、預後差。全世界每年約有500萬例GIC新發病例，GIC相關死亡占所有癌症相關死亡的35%[1]。是以，尋找新的治療方案是臨床亟需解決的難題。
近年來，癌症免疫療法取得突破性進展，尤其是嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）過繼細胞療法對白血病/淋巴瘤療效顯著[2]，但CAR-T對GIC和NET等實體瘤的治療尚處于空白階段，部分原因是缺乏合适的惡性良性腫瘤特異性抗原和相應的單克隆抗體，是以探索安全且可靶向的惡性良性腫瘤特異性抗原是解決這一挑戰的關鍵。
近日，美國賓夕法尼亞大學華先欣教授及其團隊分離出一種源自美洲駝的納米抗體（VHH1），這種抗體可與人腸上皮細胞及部分胰腺導管上皮細胞表面的肝腸鈣粘蛋白17（CDH17）結合，VHH1-CAR-T細胞（CDH17CAR-Ts）以CDH17依賴的方式消除人和小鼠惡性良性腫瘤細胞。
尤其值得一提的是，雖然健康組織細胞也會表達表達CDH17，但是正常細胞表面的CDH17位于腸上皮細胞之間的緊密連接配接處，而免受CDH17CAR-Ts的攻擊[3]。
這一研究表明，CDH17是GIC和NET嵌合抗原受體T細胞治療的理想靶點，為進一步探索惡性良性腫瘤相關抗原和開發治療實體惡性良性腫瘤的安全免疫療法提供了新的思路。相關研究成果，近期發表在著名期刊《自然·癌症》（Nature Cancer）上。
論文首頁
接下來，我們看看這項研究是如何開展的。
首先，研究團隊為了探索可用于免疫治療的GIC-NET特異性抗體，使用未經免疫的美洲駝外周血單個核細胞建構VHH（納米抗體）噬菌體庫，通過篩選分離出特異性結合NET的VHH1。
為了鑒定VHH1靶向的蛋白質抗原，研究人員制備了3000個人類細胞膜蛋白互補DNA，并将其轉染到HEK293T（人胚腎細胞）細胞中，然後用表達VHH1的噬菌體進行篩選，分析發現，VHH1僅與細胞表面粘附蛋白CDH17結合。
CDH17又名肝腸鈣粘蛋白，是一種具有七個胞外鈣粘蛋白（EC）結構域的細胞粘附蛋白，主要表達于腸上皮細胞及部分胰腺導管上皮細胞，在GIC和NET惡性良性腫瘤細胞中表達上調。
接下來，研究人員使用7個結構域單獨發生突變的CDH17突變體去轉染細胞，然後用流式細胞術去檢測與VHH1的結合情況，研究發現，EC1結構域缺失的CDH17突變體喪失了與VHH1結合的能力，說明VHH1與EC1結構域特異性結合。
随後，研究人員對35例NET患者的惡性良性腫瘤組織進行了免疫組織化學染色（IHC），結果顯示，35例樣本中19例（54.3%）高表達CDH17，其中，14例小腸來源的NET惡性良性腫瘤組織中有12例（85.7%）CDH17染色陽性，而15例胰腺來源的NET惡性良性腫瘤組織中有6例（40%）CDH17染色陽性。雖然NET惡性良性腫瘤細胞存在惡性良性腫瘤内異質性，一些惡性良性腫瘤細胞失去了CDH17的表達，但在19例CDH17陽性的樣本中有13例樣本90%以上的惡性良性腫瘤細胞高表達CDH17。
以上資料表明，CDH17是開發CAR-T療法治療NETs和其他胃腸道惡性良性腫瘤的合适靶點。
分離VHH1并證明其與在NETs中高度表達的CDH17特異性結合
那麼，VHH1是否能夠引導T細胞殺死NET惡性良性腫瘤細胞呢？
首先，研究團隊建構了CDH17特異性嵌合抗原受體T細胞：VHH1-CAR-T細胞（CDH17CAR-Ts）。已有研究表明，T細胞和靶細胞之間的距離對于免疫突觸的形成，以及随後對靶細胞的殺傷至關重要[4]。
是以，研究人員建構了5種不同鉸鍊長度的嵌合抗原受體（CAR）：H38CAR（鉸鍊區為IgG3 + CD8）、H3CAR（鉸鍊區為IgG3）、H8CAR（鉸鍊區為CD8）、H3sCAR（鉸鍊區為IgG3s）、H4CAR（鉸鍊區為IgG4）。随後，他們将這5種CARs以及空載體分别轉導到人T淋巴細胞株JRT3，結果顯示，轉導較短鉸鍊CAR（CD8、IgG3s和IgG4）的JRT3可以有效殺死BON細胞（人胰腺神經内分泌瘤細胞），但對BT474細胞（人乳腺導管癌細胞）沒有殺傷作用。
接下來，研究人員用以上不同鉸鍊長度的CARs轉導人原代T細胞，得到了相同的結果，并且轉導H4CAR（IgG4鉸鍊區最短）的T細胞對惡性良性腫瘤細胞的殺傷效果最好。
這些結果表明，轉導短鉸鍊的VHH1-CAR-T細胞可以特異性殺死人胰腺神經内分泌瘤細胞。
篩選可以特異性有效殺傷NETs細胞的嵌合抗原受體T細胞
接下來，研究人員為了探索是否能夠進一步增強VHH1-CAR-T在殺死實體瘤方面的效力，分别建構了僅含有4-1BB共刺激結構域的第二代VHH1-CAR（VHH1-BBz）和包括CD28和4-1BB（VHH1-28BBz）兩個共刺激結構域的第三代VHH1-CAR。
随後，用CDH17慢病毒轉導人卵巢癌細胞（SKOV3細胞），進一步篩選出表達CDH17的SKOV3細胞，然後用VHH1-BBz-CAR-T和VHH1-28BBz-CAR-T分别與野生型SKOV3細胞（WT-SKOV3）和表達CDH17的SKOV3細胞（CDH17-SKOV3）共培養。
結果顯示，兩種VHH1-CAR-T在體外均能有效地殺死CDH17-SKOV3細胞，值得注意的是，VHH1-28BBz-CAR-T比VHH1-BBz-CAR-T更能有效地殺死CDH17-SKOV3細胞；同時，與CDH17-SKOV3細胞共培養時，VHH1-28BBz-CAR-T釋放的幹擾素（IFN）和惡性良性腫瘤壞死因子（TNF）也比VHH1-BBz-CAR-T多，但與WT-SKOV3細胞共培養時兩種嵌合抗原T細胞均未發現對惡性良性腫瘤細胞的殺傷作用和細胞因子的釋放，這表明CDH17誘導了CAR-T激活。
為了進一步評估兩代VHH1-CAR-T在體内以CDH17依賴性方式抑制SKOV3異種移植惡性良性腫瘤的效果，将WT或CDH17-SKOV3細胞分别移植到NSG小鼠體内，然後分别給小鼠注射未轉導（UTD）T細胞和兩代VHH1-CAR-T。
結果顯示，對照組注射UTD T細胞的小鼠惡性良性腫瘤呈指數增長，注射第二代VHH1-BBz-CAR-T可顯著抑制惡性良性腫瘤生長，但不能根除惡性良性腫瘤，而注射第三代VHH1-28BBz-CAR-T可特異性根除CDH17-SKOV3惡性良性腫瘤并且可以延長總生存期，但不影響CDH17陰性WT-SKOV3惡性良性腫瘤的生長。以上結果，與流式細胞術分析結果一緻，注射第三代VHH1-28BBz-CAR-T的荷瘤小鼠外周血中CD3+T細胞數量最高。
這一系列實驗表明，第三代VHH1-28BBz-CAR-T以靶向CDH17依賴性方式在體内根除實體瘤。
CDH17CAR-Ts在體内可消除表達CDH17的SKOV3實體瘤
随後，研究人員使用了一種新的高分化人胰腺神經内分泌惡性良性腫瘤細胞（NT-3）進行了進一步驗證，體外細胞毒性試驗顯示，VHH1-BBz-CAR-T和VHH1-28BBz-CAR-T在體外均能殺死NT-3細胞，其中第三代VHH1-28BBz-CAR-T對NT-3的殺傷效果更強，與NT-3細胞共培養時，釋放的IFN-γ和TNF更多。
進一步體内動物試驗結果顯示，VHH1-BBz-CAR-T可以抑制NT-3惡性良性腫瘤的生長，但沒有消除惡性良性腫瘤；值得注意的是，VHH1-28BBz-CAR-T在體内消除了NT-3惡性良性腫瘤。
以上實驗結果，研究人員在人胰腺癌細胞系ASPC1和HPAFII和兩種胃癌細胞系SNU-16和SNU-5中得到了進一步驗證。
惡性良性腫瘤組織免疫化學染色和免疫熒光（IF）染色顯示結果顯示，注射UTD T細胞的小鼠，惡性良性腫瘤組織中檢測到胰島樣NT-3惡性良性腫瘤細胞，注射第二代VHH1-BBz-CAR-T治療的小鼠的NT-3惡性良性腫瘤周圍有大量小而細胞核密集的T細胞，注射第三代VHH1-28BBz-CAR-T治療的小鼠未檢測到NT-3惡性良性腫瘤細胞，但檢測到大量T細胞。另外，在注射VHH1-28BBz-CAR-T後，部分小鼠的惡性良性腫瘤大小短暫增加，這可能是由于CAR-T遷移到惡性良性腫瘤部位後大量增生并且釋放細胞因子所緻。
以上結果表明，表明第三代VHH1-28BBz-CAR-T惡性良性腫瘤浸潤和清除NET和GIC惡性良性腫瘤細胞比第二代CAR-T更有效。
值得注意的是，與第二代CAR-T治療後的小鼠中度體重減輕相比，第三代CAR-T治療後沒有觀察到明顯的體重減輕；在第一次注射CAR-T後第10天左右，小鼠腸道沒有發現明顯損傷，第二代VHH1-BBz-CAR-T治療的小鼠惡性良性腫瘤減小伴随體重減輕的原因目前尚不清楚。
此外，與注射UTD T細胞和VHH1-BBz-CAR-T相比，注射VHH1-28BBz-CAR-T治療的小鼠循環血液中的CD3+T細胞數量最高。
CDH17CAR-Ts在小鼠體内對NT-3惡性良性腫瘤的殺傷作用
但是研究人員使用BON細胞進一步驗證以上結果時發現，VHH1-28BBz-CAR-T可以顯著抑制小鼠體内BON細胞形成的異種移植惡性良性腫瘤，但不能消除惡性良性腫瘤。這說明，VHH1-CAR-T以CDH17依賴性方式殺傷惡性良性腫瘤細胞，然而，并非所有表達CDH17的惡性良性腫瘤細胞對CAR-T介導的殺傷都同樣敏感，BON細胞對CAR-T敏感性降低的機制值得進一步研究。
CAR-T治療面臨的一個重要問題就是對健康細胞的靶向毒性，CDH17在NET惡性良性腫瘤細胞中高度表達，但也在人和小鼠腸上皮細胞中表達，那麼，CDH17CAR-T在體内殺死惡性良性腫瘤細胞的同時是否對健康的腸上皮細胞也有殺傷作用呢？
為了探索這一問題，研究團隊首先檢測了小鼠作為評估CAR-T治療對正常細胞毒性的可行性，并建構了VHH1-28BBz-CAR（mCAR）的小鼠版本。
随後，研究人員建立了原位原發性結直腸癌（CRC）小鼠模型，将CRC小鼠注射mUTD T細胞或mVHH1-28BBz-CAR-T；在研究結束時，将小鼠殺死并解剖，在對照小鼠中顯示出明顯的惡性良性腫瘤，經mCAR-T治療的小鼠惡性良性腫瘤負荷減輕，對照組和CAR-T治療組小鼠的惡性良性腫瘤總體積的定量分析表明，CAR-T注射顯著減少了惡性良性腫瘤體積；進一步組織學研究顯示，mCAR-T注射小鼠的惡性良性腫瘤中浸潤的CD3+T細胞明顯多于mUTD T細胞注射小鼠的惡性良性腫瘤。
總之，這些實驗結果表明，在這些同基因原位惡性良性腫瘤模型中，mVHH1-28BBz-CAR-T可以顯著降低原發性結直腸癌的惡性良性腫瘤負荷，且惡性良性腫瘤部位T細胞的浸潤明顯增加。
CDH17CAR-Ts可顯著降低WT C57BL/6J小鼠中原發性結直腸癌惡性良性腫瘤負荷
以上結果已證明VHH1可與人和小鼠CDH17結合，并且由此産生的CAR-Ts也能有效殺死小鼠惡性良性腫瘤細胞，接下來，研究人員收集UTD T細胞或VHH1-CAR-T治療10天的NT-3荷瘤NSG小鼠的健康組織，免疫組化染色顯示，用VHH1-CAR-T治療後，小腸和結腸完好無損，這些健康組織沒有明顯的組織損傷；此外，在胰腺、胃、心髒、肝髒和腎髒中也未觀察到明顯的組織損傷。
最後，研究人員通過免疫熒光（IF）染色檢測了人CAR-T浸潤到正常小鼠小腸和結腸的情況，結果顯示，接受VHH1-CAR-T治療的小鼠，在其高表達CDH17的NT-3惡性良性腫瘤中觀察到大量T細胞浸潤，注射UTD T細胞的小鼠惡性良性腫瘤中沒有觀察到T細胞的浸潤。
值得注意的是，用UTD T細胞或VHH1-CAR-T治療攜帶隐匿表達CDH17的NT-3惡性良性腫瘤時，在小鼠的小腸或結腸中未發現T細胞浸潤，盡管受體小鼠的正常組織具有豐富的CDH17表達。為了確定VHH1能夠與健康小鼠組織中的内源性CDH17結合，研究人員使用VHH1和兔抗VHH抗體進行了IF染色，發現VHH1确實可以與表達CDH17的NT-3惡性良性腫瘤，以及表達正常CDH17的小鼠小腸上皮細胞結合，但不能與CDH17陰性的胰腺或胃細胞結合。
值得注意的是，CDH17主要表達于小鼠腸上皮細胞的外側，而不是頂端或基底側，這表明VHH1-CAR-T不能靶向正常小腸或結腸的一個原因可能是VHH1-CAR-T不能到達或結合到腸上皮細胞緊密連接配接處外側的CDH17。相比之下，由于缺乏極性，惡性良性腫瘤細胞在其細胞表面表達CDH17，這可能會增強惡性良性腫瘤細胞對CAR-T介導的殺傷的敏感性。那麼，如果腸上皮的完整性受損，是否會有更多的T細胞滲入腸道呢？
随後，研究團隊給野生型（WT）免疫活性小鼠注射mVHH1-CAR-T，然後将其分為兩組，一組小鼠飲用純淨水，另一組小鼠飲用含有DSS（葡聚糖硫酸鈉，是常見的誘導潰瘍性結腸炎的藥物）的水；結果顯示，DSS治療導緻結腸長度縮短，組織學研究表明，DSS治療會破壞腸上皮的完整性；定量分析表明，用DSS處理注射CAR-T的小鼠可顯著增加CD3+T細胞向受損腸上皮的浸潤。
雖然這項研究本身并不能直接證明緊密連接配接阻止了CAR-T，但它與腸上皮完整性或緊密連接配接對于阻止CAR-T滲透至關重要的觀點是一緻的。
以上研究結果表明，VHH1-CAR-T在根除表達CDH17的NT-3惡性良性腫瘤的同時，保留了同樣表達CDH17的健康小腸和結腸，表明用于開發治療GIC和NET的CAR-T療法，CDH17是一個安全有效的靶點。
腸上皮損後T細胞向結腸浸潤增加
惡性良性腫瘤特異性抗原的缺乏是限制CAR-T用于治療實體瘤（包括GIC和NETs）發展的主要挑戰之一，是以需要确定安全且可靶向的TAA。
總的來說，本研究表明，CDH17是GIC和NET嵌合抗原受體T細胞治療的理想靶點；CDH17在GIC和NET中表達上調；VHH1-CAR-Ts（CDH17CAR-Ts）可以根除表達CDH17的惡性良性腫瘤，包括胰腺NET、GC、PC和CRC；在多種異種移植或原位惡性良性腫瘤模型中可以根除CDH17陽性惡性良性腫瘤。
最後，CDH17CAR-T在不影響小鼠體重和腸道組織學變化的情況下根除了惡性良性腫瘤，大量CAR-Ts滲入惡性良性腫瘤組織，但在小鼠的健康組織中，包括表達CDH17的小腸和結腸，沒有發現這種浸潤。總之，這項研究表明，CDH17是用于過繼免疫治療NET和其他CDH17陽性的實體瘤的潛在靶點。
參考文獻：
1.Arnold M, Abnet CC, Neale RE, et al. Global Burden of 5 Major Types of Gastrointestinal Cancer. Gastroenterology. 2020;159(1):335-349.e15. doi:10.1053/j.gastro.2020.02.068
2.Grupp SA, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia [published correction appears in N Engl J Med. 2016 Mar 10;374(10):998]. N Engl J Med. 2013;368(16):1509-1518. doi:10.1056/NEJMoa1215134
責任編輯丨BioTalker