撰文 | 鄭詩蔚 責編 | 許楓
液體活檢由于其采樣快、侵入性低，目前已經成為一種有效的癌症檢測工具。癌症患者的遊離DNA裡包含循環惡性良性腫瘤DNA（ctDNA），通過分析惡性良性腫瘤病人的遊離DNA可以檢測到惡性良性腫瘤相關的遺傳和表觀的改變。帶有大量遊離DNA的兒童惡性良性腫瘤病患往往其臨床結果不理想，一些早期研究更進一步闡明了液體活檢在疾病監測方面的價值。
目前對兒童癌症中遊離DNA的分析側重于惡性良性腫瘤的基因标志物檢測，例如染色體易位造成的融合基因和拷貝數變異等。這些資料通常來自于微滴式數字PCR或目标二代測序，這種方法敏感度低，且通常隻關注了少數幾個基因片段，而且大多數兒童癌症樣本的基因組不會存在重複出現的序列異常。但研究人員發現，遊離DNA片段模式能提供非常有用的資訊，包括目标DNA來源，染色質結構以及惡性良性腫瘤細胞的表觀态等。是以，分析遊離DNA片段中包含的資訊，能夠和傳統基于基因标志物的檢測手段形成很好的互補，并幫助醫護人員更好地制定個性化的治療方案。
2021年5月28日，奧地利CeMM研究中心的Bock課題組聯合奧地利聖安娜兒童癌症研究所的Tomazou課題組，在Nature Communications上發表題為Multimodal analysis of cell-free DNA whole-genome sequencing for pediatric cancers with low mutational burden的文章。研究人員對95位尤文肉瘤患者，31位其他種類肉瘤患者，加上22位健康對照組中采集的共241份遊離DNA樣本進行了深度測序，并且對DNA片段的分布進行了詳盡的分析。運用生物資訊學和機器學習算法，研究人員總結出與尤文肉瘤相關的遊離DNA片段分布規律和相關表觀遺傳特征，還建立了遊離DNA片段與兒童實體瘤的臨床關聯。
研究人員首先在宏觀上統計了DNA片段的長度分布。他們發現，尤文肉瘤樣本的遊離DNA片段長度明顯短于健康對照組樣本，長度集中于167bp——這與和機關核小體環繞的DNA長度相近。研究人員還發現，遊離DNA片段長度偏短這一現象并不是尤文肉瘤獨有的，在許多成人惡性良性腫瘤（肺癌和結腸癌）以及其他兒童肉瘤樣本中也存在相同的現象。
另外，在許多未檢測到惡性良性腫瘤标志物的尤文肉瘤患者中，遊離DNA片段長度仍然明顯短于健康對照組。此外，研究人員還利用長度偏短這一特征，發現對遊離DNA片段進行長度過濾，能提高尤文肉瘤樣本中基因拷貝數變異檢測的靈敏度。由于兒童惡性良性腫瘤中基因拷貝數變異的現象相對不普遍，遊離DNA片段長度分析或許能與傳統檢測手段形成互補，對未來的臨床研究和檢測可能大有幫助。
短遊離DNA片段（20-150bp）在兒童肉瘤和成人癌症樣本中的比例分布（對比健康人對照組）
除宏觀統計外，研究人員還着重分析了在不同基因組位點上遊離DNA片段長度的富集差異。研究人員首先将全基因組分為100kb的連續區間，然後計算每個區間内短片段（100~150bp）和長片段（151~220bp）的數量比（S/L比），并與健康對照組的結果進行比較。他們發現在尤文肉瘤和其他兒童肉瘤中，惡性良性腫瘤DNA片段的S/L比在整條染色體中并不是均勻分布的，而且這種差異分布現象在移除帶有拷貝數變異的區間後仍然存在。
為了探索這種差異分布的生物學意義，研究人員随後将存在差異分布的基因區間序列用LOLA軟體做了富集分析，結果顯示高S/L比（短片段集中）的位點與尤文肉瘤樣本的H3K27ac ChIP-seq和尤文肉瘤特異的DNase I易感位點互相吻合，顯示它們處于染色質開放狀态，在其他類型惡性良性腫瘤樣本中則沒有檢測到這種特殊現象。
尤文肉瘤，其他兒童肉瘤和健康樣本中對比對照組log2(S/L)值在不同染色體臂的分布
鑒于遊離DNA片段化在整個基因組的不均勻分布展現了尤文肉瘤惡性良性腫瘤細胞的染色質結構，研究者進一步探索在未知遺傳改變的條件下，檢測遊離DNA惡性良性腫瘤來源的可行性。為此，研究人員開發了一款名為LIQUORICE（liquid biopsy regions-of-interest coverage estimation）的軟體，用于比對遊離DNA片段和與各種不同癌症相關的目标基因區域，并計算不同位點的遊離DNA覆寫率。當應用LIQUORICE在尤文肉瘤的樣本時，研究人員計算了以下四種目标基因區域的片段覆寫率：1）尤文肉瘤特異的DNase I染色質開放位點；2）EWS-FLI1結合位點；3）EWS-FLI1正相關增強子；4）EWS-FLI1負相關增強子。
在尤文肉瘤患者，特别是在可檢測到惡性良性腫瘤标志物的樣本中，LIQUORICE結果顯示遊離DNA在1-3類位點的覆寫率相比其他肉瘤和健康對照組顯著下降。為了證明EWS調控區域遊離DNA的減少反映惡性良性腫瘤的表觀狀态，研究人員還對尤文肉瘤樣本在全基因組規模做了甲基測序，結果顯示在出現覆寫率下降的位點中，這些位點的甲基化程度顯著降低，以此确認在片段覆寫率下降與染色質結構改變相關。
對照組和惡性良性腫瘤樣本遊離DNA片段在不同目标基因區間的覆寫率
最後，研究人員運用機器學習方法，探索能否通過遊離DNA片段中隐藏的資訊來預測尤文肉瘤病例。他們用文中提及的三種片段的定量統計方法（宏觀片段大小，片段全基因組區間分布S/L比，目标基因組區間片段覆寫率），加上拷貝數變異作為輸入資料進入分類器，發現訓練後的分類器模型能夠準确分辨尤文肉瘤病人和健康人的遊離DNA（AUC值=0.97）。另外，訓練後模型分類的靈敏度大大高于基于遺傳學的傳統分類方法（例如通過全基因組測序檢測EWS-Ets融合基因），即使在0.1x的測序深度下分類器依然能準确區分尤文肉瘤樣本資訊。
分類器預測尤文肉瘤和健康對照組樣本的ROC曲線圖
綜上所述，這份研究中展示了運用液體活檢中遊離DNA片段資訊的新思路。差別于傳統惡性良性腫瘤标志物檢測，遊離DNA片段大小，在全基因組區間片段長度的差異分布，以及在目标基因區間的不同覆寫率均可以有效标記尤文肉瘤樣本。通過生物資訊學分析，研究人員還充分說明了遊離DNA片段中包含了重要的表觀遺傳資訊。由于許多兒童惡性良性腫瘤的基因突變率相比成人癌症要低，這項研究提出的遊離DNA片段模式分析，有潛力提升兒童惡性良性腫瘤的臨床檢測與監控效率。
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排版 | 車潔 校對 | uu