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今日，《自然》雜志線上發表了一篇北京大學研究團隊的最新論文。毛有東教授領銜的科研團隊，使用國際前沿的創新技術，大幅提升冷凍電鏡的時間分辨率分析精度，揭示了人源蛋白酶體（proteasome）的動力學調控機制。
研究團隊指出，作為影響細胞内蛋白質降解的生命分子機器，蛋白酶體是治療一系列重大疾病的藥物靶點，是以對其動力學調控和構象變化實作精準觀察，有望推動新一輪藥物研發的重大創新。
在真核細胞（包括人類細胞）内，泛素-蛋白酶體系是定向降解蛋白質的一種主要方式。2004年，諾貝爾化學獎授予三位科學家，表彰他們對該泛素化蛋白質降解機制的曆史性發現。在這一過程中，待降解的蛋白質作為底物被打上“泛素”标記，進而被蛋白酶體識别；然後，蛋白酶體如同一台蛋白質粉碎機，将底物切割成碎片，實作精準降解。蛋白酶體功能紊亂，與癌症、神經退行性疾病、免疫疾病等一系列人類疾病有關。
圍繞蛋白酶體，毛有東教授實驗室在先前的一系列工作中，基于冷凍電鏡技術逐漸揭示了其原子架構、組裝原理和降解泛素化底物的動力學基本規律。蛋白酶體全酶又稱為26S proteasome，由中間一個圓柱形20S核心顆粒和兩端覆寫的一個或兩個19S調節顆粒組成。19S包含一個環形異源六聚體馬達——AAA-ATPase，通過多個協同ATP水解模式調控蛋白酶體降解泛素化底物。
▲該研究的通訊作者毛有東教授（圖檔來源：北京大學官網）
在正常細胞中，蛋白酶體的功能受到多個水準的嚴格調控。去泛素化酶USP14就是蛋白酶體的一個主要調控分子，它通過與蛋白酶體發生可逆的結合，切除底物上的泛素鍊。
然而，這一過程速度極快，蛋白酶體降解底物的時間尺度在毫秒到秒之間，是以要看清USP14如何被蛋白酶體激活并調控蛋白酶體功能，始終是個世界級的難題。
而這正是此次研究的突破所在：在原子水準上呈現了蛋白質降解過程中USP14和蛋白酶體的構象連續體。
▲USP14調控下蛋白酶體複合體降解多泛素化底物的原子結構模型之一 (A)， 時間分辨率冷凍電鏡解析13種中間态的統計分布随蛋白質降解程序的時間演化(B)（圖檔來源：毛有東教授/CC BY 4.0）
為了用冷凍電鏡技術捕獲該過程的中間态結構，研究團隊首先設法放慢了這個過程。通過大量的條件摸索，重建反應動力學體系和優化反應條件，研究人員獲得了45000多張含時USP14-降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了超過300萬個USP14-26S-泛素底物複合體的顆粒圖像。
接下來，更關鍵的一步是對如此大量的圖像進行分類，呈現出蛋白反應的動态過程。為此，研究組借助人工智能，利用經過數年自主開發的新型深度學習高精度三維分類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S複合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀态的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，重建出受控蛋白酶體的完整動力學工作周期。
“這是國際上首次将人工智能四維重建技術用于大幅提升時間分辨冷凍電鏡分析精度。”研究團隊強調。
▲通過時間分辨冷凍電鏡分析擷取的USP14調控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型（圖檔來源：毛有東教授/CC BY 4.0）
結合分子生物學功能和基因突變研究，這項研究工作最終闡明了USP14和26S蛋白酶體互相調控活性的原子結構基礎和非平衡動力學機制。
研究發現，USP14的活化同時依賴于泛素識别和蛋白酶體RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過别構效應，誘導蛋白酶體同時沿着兩條并行狀态轉變路徑發生構象變化。該研究成功捕獲到了底物降解中間狀态向底物抑制中間狀态的瞬時轉化，為USP14調節26S蛋白酶體的完整功能周期提供了全新的高分辨見解。
《自然》同期發表的評論文章中，審稿人對該研究有着很高的評價，指出“該工作是一項重大研究，終于在原子水準解決了USP14活化和其調控蛋白酶體功能的機制問題”。
“這項突破對于發現靶向藥物有多重意義。”毛有東教授指出，“過去我們基于結構的藥物設計是靜态的‘死結構’，現在我們可以針對靶蛋白實際執行功能的動态過程中的高分辨構象有的放矢地設計藥物分子，‘打’的是有實際功能的構象；其二，精準定義靶蛋白的動态過程，我們就可以更好地預測藥物分子作用機制和動力學，有更多可以選擇打靶的中間态構象，進而極大擴充了藥物分子的可設計空間，提高分子設計的成功機率。此外，相比分子動力學計算模拟的方法，我們的技術看的是真實的動力學，也對于靶蛋白分子量沒有上限。更重要的是，我們看的是‘功能動力學’，是真實的藥物分子要去結合的靶構象，這個在可見的将來還難以用分子動力學計算模拟來實作。”
參考資料：
[2] Control of human protein-degradation machinery revealed. Nature
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