谷歌風投盯上的這項技術，有望從根本上治療癌症

導語：衆所周知，在體基因編輯可以通過對體内靶細胞的基因編輯，敲除緻病基因或插入功能性基因，以治療從前被認為無法治愈的疾病，如遺傳病和癌症等。2020年，CRISPR基因編輯技術榮獲諾貝爾化學獎；2021年6月27日，首個體内CRISPR基因編輯安全性和效果的臨床資料在NEJM公布，結果表明單次靜脈注射CRISPR可精确編輯體内的靶細胞，治療基因疾病。

基因編輯技術可從根本上治療癌症

基因編輯技術多用于基因功能研究和疾病治療，常用工具包括鋅指核糖核酸酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）、轉錄激活樣效應因子核酸酶（Transcription Activator Like Effector Nuclease，TALEN）和CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated）系統（表1）。

表1 三種基因編輯技術的比較

資料來源：[1]丨制表：生物探索編輯團隊

CRISPR/Cas系統廣泛存在于細菌和大部分古生菌的天然免疫系統，主要由兩部分組成：編碼Cas蛋白的基因和由前導序列、不連續的重複序列、長度相似間隔序列組成的CRISPR序列。其應用條件包括：待編輯區域有保守的PAM序列(Proto-spacer Adjacent Motifs)、可與PAM上遊序列互補配對的sgRNA和發揮功能的Cas酶。與傳統的基因編輯工具相比，CRISPR/Cas系統優點突出。

根據效應蛋白的不同，CRISPR/Cas系統分為兩類(圖1)：1類系統是由多種不同效應蛋白組成的複合物，通常形成多亞基蛋白crRNA(CRISPR RNA)效應複合物，包括I、Ⅲ和Ⅳ三種類型和12種亞型；2類系統隻有單個效應蛋白（Cas9、Cas12、Cas13）進行目的基因的幹擾，約占CRISPR/Cas系統的10%，包括II、Ⅴ和Ⅵ型和9種亞型，除了切割DNA，2類系統中的Cas13a （C2c2）可以靶向切割ssRNA (Single-stranded Ribonucleic Acid)。

圖1 CRISPR/Cas系統的分類（圖源：[1]）

CRISPR/Cas系統的作用機制分為三個階段(圖2)

(1) 适應：攝取外源遺傳物質

外源遺傳物質入侵後，CRISPR/Cas系統識别外源基因的PAM序列，并從PAM序列附近擷取部分外源片段形成間隔序列，從5’端整合到CRISPR重複序列之間使之具有“記憶”，可在下次感染時對入侵核酸特異性破壞，多數已知的CRISPR/Cas系統在此過程中需要Cas1-Cas2複合物的參與。

(2) 表達：crRNA的表達和成熟

CRISPR區域首先轉錄成pre-crRNA，之後被切割為包含1個間隔序列和部分重複序列的成熟crRNA，直接或進一步加工後與Cas蛋白結合成“效應子”或“幹擾”複合物，具有特異性核酸内切酶活性。

(3) 幹擾：對外源遺傳物質進行剪切

複合物在crRNA的引導下沿外源遺傳物質進行掃描，當遇到PAM序列附近有crRNA比對區域，效應複合物進行切割促進核酸分子降解，外源核酸表達沉默。

Cas9屬于2類Ⅱ型CRISPR系統，自2013年在人類細胞中得到驗證以來成為應用最廣泛的基因組編輯工具，為了使其有更大的作用範圍，這一工具的開發也在不斷深入。

圖2 CRISPR/Cas作用機制示意圖（圖源：[1]）

惡性良性腫瘤是由體細胞突變積累形成的，根據癌症類型有不同的突變基因及突變位點。傳統的癌症治療方法效果有限，複發性高，通過基因編輯技術使緻癌基因失活或抑癌基因激活，進而改變下遊信号通路進行癌症治療，可以從根本上治療疾病。CRISPR/Cas9作為一種基因編輯工具，可用于開展同源定向修複、基因敲除、插入、染色體異位、染色質重組、疾病診斷等工作。目前，CRISPR/Cas9技術已應用于惡性良性腫瘤治療中的基礎研究（表2）及生物治療（表3）。

表2 CRISPR/Cas9在惡性良性腫瘤治療中的基礎研究

表3 CRISPR/Cas9介導的惡性良性腫瘤生物治療

CRISPR技術優勢突出，臨床應用如何

2021年6月17日，The New England Journal of Medicine（NEJM）報道了世界首例支援體内CRISPR基因編輯安全性和效果的臨床資料（圖3）。此項研究由倫敦大學醫學部國家澱粉樣變性中心、倫敦聖喬治大學、皇家自由學院、奧克蘭大學和紐西蘭臨床研究等團隊共同完成，并由Intellia Therapeutics和Regeneron聯合贊助。

圖3 研究成果（圖源：NEJM）

轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性（ATTR）是一種危及生命的疾病，其特征是錯誤折疊的轉甲狀腺素蛋白（TTR）蛋白主要在神經和心髒中進行性積累。NTLA-2001是體内基因編輯治療劑，旨在通過降低血清中TTR濃度來治療ATTR澱粉樣變性。NTLA-2001基于成簇規則間隔的短回文重複序列和相關的Cas9核酸内切酶（CRISPR-Cas9）系統，通過脂質納米顆粒封裝Cas9蛋白的信使RNA和靶向TTR的單向導RNA（圖4）。

圖4 NTLA-2001的作用機制（圖源：NEJM）

此項研究公布的中期臨床資料涵蓋了在1期臨床試驗中接受治療的6名ATTR患者，其中3名接受劑量為0.1 mg/kg的NTLA-2001的治療，另外3名接受的劑量為0.3 mg/kg。通過檢測病人血清中TTR濃度水準、NTLA-2001體内藥理學、NTLA-2001體外評估、評估不良事件和脫靶效應得到如下結果：

1、接受NTLA-2001治療的第28天，單劑量的NTLA-2001能夠劑量依賴性降低患者血清中的TTR水準。0.1 mg/kg劑量組TTR水準平均下降52%；0.3 mg/kg劑量組TTR水準平均下降87%，其中一名患者TTR水準下降96%；

2、接受NTLA-2001治療的第28天，NTLA-2001表現出良好的安全性，沒有發現嚴重不良事件和肝髒問題。所有不良事件均為輕度不良事件（1級）；

3、治療劑量的NTLA-2001并未産生“脫靶效應”。

此項研究資金資助人Intellia總裁兼首席執行官John Leonard博士表示：“有史以來首次體内基因編輯臨床資料表明，通過單次靜脈輸注CRISPR系統，便可在患者體内精準編輯靶細胞，進而治療遺傳疾病。NTLA-2001中期結果驗證了假設，其具有在單次給藥的情況下中止和逆轉ATTR的潛力。解決将CRISPR/Cas9系統靶向遞送至肝髒的挑戰，也為基于我們的技術平台治療其他遺傳疾病打開了大門，我們計劃快速推進和擴充我們的研發管線。這些資料讓我們相信，我們正在真正開啟醫學的新時代。”

谷歌風投看好CRISPR技術，加倉初創公司

2022年3月22日，成立于2017年的Spotlight Therapeutics（以下簡稱“Spotlight”）宣布獲得3650萬美元的B輪融資，由此，Spotlight的融資總額達8070萬美元。此輪融資由GordonMD Global Investments和EPIQ Capital Group共同領投，Magnetic Ventures以及現有投資者GV（前身為Google Ventures）和Emerson Collective等投資者參投（表4）。

表4 Spotlight Therapeutics融資資訊

資料來源：[3]丨制表：生物探索編輯團隊

Spotlight緻力于開發在體CRISPR基因編輯療法，并擁有專有的技術平台靶向活性基因編輯器（Targeted Active Gene Editors，TAGE）平台。TAGE平台将細胞穿透肽（CPP）、配體和抗體靶向細胞的類别、以及多種核酸酶的原型分子等進行“零件化/子產品化”，并建立了一個零件庫，通過将這些“零件”/“子產品”進行組合，以實作最佳的細胞選擇性和功效的分子。這種“零件化/子產品化”的方法能夠避免目前細胞、病毒和納米載體遞送方法的複雜性和毒性（圖5）。

圖5 TAGE平台（圖源：Spotlight Therapeutics官網）

TAGE能夠在體内靶向標明的細胞類型。這有可能提高治療有效性，并能夠編輯目前遞送方法不易靶向的細胞類型。TAGE的“零件化/子產品化”配置允許通過改變細胞靶向部分、CRISPR效應子和gRNA來建立“合适用途”的分子。同時，TAGE的半衰期短，是以在完成任務後不會在體内持續存在。這就降低了脫靶的風險，最大限度地減少了抗藥物免疫反應的可能性，并在劑量方面擁有更大的靈活性。

Spotlight總裁兼首席執行官Mary Haak-Frendscho博士表示：“此次B輪融資是重要的裡程碑，這使我們可以推進免疫惡性良性腫瘤學（IO）項目（圖6），同時也可以開展在眼科疾病和血紅蛋白病方面的項目。将使我們能夠利用Spotlight獨特的細胞靶向體内遞送方法釋放基因編輯的全部潛力，為患者提供有效的一次性治療藥物。”

圖6 IO項目（圖源：Spotlight Therapeutics官網）

CRISPR/Cas9系統能很好地突破傳統診斷、治療惡性良性腫瘤方法的局限性，是一種革命性的癌症治療方式。相信随着研究的不斷深入，CRISPR/Cas9會在惡性良性腫瘤基礎研究和臨床應用方面發揮更大作用。

題圖來源：Spotlight Therapeutics官網，僅用于學術交流。

撰文|文競擇

排版|木子久

End

參考資料：

[1]馬孟丹,楊育賓,陳延萍,等.CRISPR/Cas9技術及其在惡性良性腫瘤研究與治療中的應用[J]生命科學,2021,33(11):1370-1381.DOI:10.13376/j.cbls/2021153.

[2]Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502. doi:10.1056/NEJMoa2107454. Epub 2021 Jun 26. PMID: 34215024.

[3]https://www.crunchbase.com/organization/spotlight-therapeutics/company_financials

本文系生物探索原創，歡迎個人轉發分享。其他任何媒體、網站如需轉載，須在正文前注明來源生物探索。