大家好，今天為大家帶來的文章是2024年2月16發表在ACS Catalysis上的“Bacterial Lactonases ZenA with Noncanonical Structural Features Hydrolyze the Mycotoxin Zearalenone”，通訊作者是帝斯曼-芬美意動物營養與健康研發中心的Wulf-Dieter Moll和布爾諾聖安妮大學醫院國際臨床研究中心的Zbynek Prokop。
玉米赤黴烯酮(ZEN)是由稻谷鐮刀菌和其他植物緻病性鐮刀菌産生的一種真菌雌激素聚酮。谷物中ZEN的污染是常見的，利用真菌内酯酶對其進行水解解毒已被探索。在這裡，作者報道了一株具有ZEN水解活性的Rhodococcus erythropolis PFA D8−1的分離，線上性質粒pSFRL1上克隆了編碼α/β水解酶ZenA的基因，并對其9個同源物進行了生化鑒定。此外，作者報道了位點定向誘變和結構分析的R. erythropolis的二聚體和更耐熱的Streptomyces coelicoflavus的四聚體（沒有結合配體）。x射線晶體結構不僅揭示了α/β水解酶的典型特征，包括Ser-His-Asp催化三元結構域，還揭示了α/β水解酶的不尋常特征，包括不常見的氧陰離子空穴基序和參與四聚體互相作用的外圍反平行短β片。ZenARe和ZenAScfl的預穩态動力學分析确定了反應循環的平衡限速步驟，該步驟可随溫度而變化。一些新的細菌ZEN内酯酶比已知的真菌ZEN内酯酶具有更低的KM和更高的kcat，可能有助于酶技術的發展，以降解飼料或食品中的ZEN。
- 1. ZEN内酯酶基因的克隆
作者對從土壤中提取的幾種細菌混合培養物進行富集培養，結果顯示ZEN降解。随後，作者對其進行劃線培養以獲得單菌落，測試各菌落培養物對ZEN轉化活性。分離的PFA D8−1顯示出快速和強大的ZEN轉化活性，16S rDNA測序鑒定其為R. erythropolis。
先前的研究表明HZEN是PFA D8−1轉化ZEN的主要代謝物。經過測定，R. erythropolis DSM 43066T和R. erythropolis PR482對ZEN無水解活性。紅孢黴PFA D8−1裂解物也能将ZEN轉化為HZEN，但在裂解前需要将生物質暴露于ZEN，并且未誘導的生物質裂解物的活性很低。
對紅孢黴的PFA D8−1進行全基因組測序，得到9個覆寫7.08 Mb的測序支架(序列存放于DDBJ/ENA/GenBank a s BioProject PRJNA884193)。其中7個支架與紅孢黴PR4基因組吻合良好，但1号和8号支架(共覆寫659 kbp)未顯示比對。紅孢黴PFA D8−1 DNA的脈沖場梯度凝膠電泳顯示660 kbp處有一條條帶。
線性巨質粒是紅孢黴的典型特征，通常含有外源藥物分解代謝的基因。作者将新的巨質粒命名為pSFRL1，并推測是否有基因能夠降解ZEN。作者試圖從脈沖場電泳凝膠中分離出pSFRL1 DNA，并将部分消化的pSFRL1 DNA克隆到大腸杆菌-紅球菌穿梭載體pMVS301.85中。然而，pSFRL1 DNA的繁瑣制備意味着全基因組DNA文庫對從分離的pSFRL1 DNA制備的文庫進行克隆和功能篩選更加合适。
通過分離基因組DNA，用具有4個堿基對識别位點的限制性内切酶(HinIII)進行部分酶切，并将片段連接配接到質粒載體pMVS301中，克隆出紅孢黴PFA D8−1基因組文庫。采用peg介導的原生質體轉化方案，将文庫轉化為紅孢黴PR4，每個克隆平均插入11.5 kbp的紅孢黴PFA D8−1基因組DNA。通過篩選具有zen水解活性的克隆，鑒定出在pMVS301中插入7781 bp的克隆P1G2。該插入物定位于pSFRL1，包含一個987 bp的ORF (DDBJ/ENA/GenBank登入為OAX51_31155)，預計編碼α/β水解酶。将該ORF擴增，插入pET-28a(+)中，轉化為大腸杆菌BL21(DE3)和HMS174(DE3)，并驗證其具有ZEN水解活性。按照細菌基因命名法的慣例，作者将該基因命名為zenARe。
2.ZenARe的酶學和生物實體特性
ZenARe上的c端6xhis标簽對大腸杆菌的酶活性和産量沒有影響(資料未顯示)，用于制備純酶。ZenARe在38°C時活性最高(圖1A)，該溫度下在孵育過程中随時間增加活性下降(圖1B)，并且在熱熒光法測定的熔化溫度範圍内(圖1C)。在30°C條件下pH 8.2時活性最高，在25°C條件下pH 6.5至pH 10範圍内孵育後，ZenARe仍保持活性(圖1D)。
圖1
序列比對可以預測催化絲氨酸（圖2），存在于親核彎的保守特征基序GXSXG90(在ZenARe中為Ser-128)和催化組氨酸(在ZenARe中為His-303)。為了鑒定催化三聯體的酸性殘留物，通過定點誘變制備了ZenARe的變體。在ZenARe的Asp-264中，在三聯體的酸性殘基通常位于的序列範圍内，是可能目标。變體D264A, D264L和D264N是具有催化活性的。另一種保守的天冬氨酸也是目标，具有氨基酸交換的酶變體D153A, D153L或D153N均未水解ZEN。是以，ZenARe的催化三元組被定義為Ser-128−His-303−Asp-153。在α/β水解酶中，氧陰離子殘基I通常位于催化親核試劑之後，氧陰離子殘基II位于β-3.91之後的環中。然而，氧陰離子殘基II的前面通常有一個(GX型)或兩個(GGGX型)甘氨酸殘基，并且在ZenARe的預測序列區域中沒有這樣的序列基序。沒有酪氨酸殘留表明存在y型氧陰離子空洞。
圖2
- 3.ZenARe同源物的生化分析
表1所列的14個ZenARe同源物是從BLAST搜尋結果中選擇的，并在大腸杆菌中使用c端6xHis-tag産生。其中8種酶可以以可溶性形式産生并純化。它們都催化了ZEN的水解，但測量的動力學參數在很大範圍内變化（表1) 。這些序列如圖2所示。最佳溫度範圍為20 ~ 50℃，最佳pH值範圍為7.0 ~ 8.5。展開溫度，由溫度斜坡上測量的熱熒光熒光強度的拐點确定，範圍從38°C到61°C。采用定點誘變的方法靶向了ZenAScfl的催化三殘基，S112A、D137A、H286A和H286Y (PDB ID: 8CLP)在大腸杆菌中表達良好，大腸杆菌裂解物的ZEN水解活性較弱，但可檢測到。
- 表1
- 4.ZenARe和ZenAScfl的預穩态動力學
作者選擇了具有高活性的ZenARe酶和具有高溫穩定性的ZenAScfl酶進行預穩态動力學分析，采用停流和淬流方法揭示了ZEN水解的動力學機制，并估計了與各個催化步驟相關的速率和平衡常數。由于生理溫度為37℃，反應速度過快，作者使用ZenARe在逐漸降低的溫度下進行動力學實驗，使其能夠精确量化每一步，并對反應熱力學有更深入的了解。作者通過傳統的分析曲線拟合開始動力學分析，以建立動力學模型，并獲得一些速率和平衡常數的初步估計(圖3)。在第二步中，正常分析拟合的結果被用作複雜全局數值模型的初始參數(圖4和5)。總體而言，動力學分析使用了一個複雜的資料集，包括來自淬流爆發和穩态資料的分子物種絕對濃度的時間分辨資訊，以及使用停流熒光方法記錄的時間分辨光譜資料。天然色氨酸熒光在不需要标記的情況下提供了所有單個催化步驟的豐富資訊。僅用酶和僅用底物進行對照注射，以驗證觀察到的信号可歸因于酶-底物互相作用而不是僞影。
首先在分析資料拟合中确定和量化單個反應物質對熒光信号的貢獻(圖3)，然後一緻地用于建構适當的比例函數進行數值拟合。作者一步一步地描述了如何識别和量化單個熒光貢獻，以及如何在支援資訊文本“動力學資料分析和統計”中建構用于模拟熒光動力學資料的最終縮放函數。
圖3
經過作者上面描述的逐漸分析，使得定義一個ZenA催化循環模型成為可能(圖4A)，它包括(1)底物結合，(2)誘導構象步驟(酶“閉合”)，(3)第一個化學步驟(中間形成)，(4)第二個化學步驟(中間到産物轉化)，(5)構象在之前的酶-産物複合物(酶“打開”)步驟，（6）最後一個産物釋放步驟。
圖4
作者利用從ZenA動力學模型中導出的速率方程的數值積分，對穩态和準穩态動力學資料進行了全局模組化(圖4A)。分析拟合的參數被用作全局拟合的起始值。在全局分析中，同時拟合了完整的資料集(圖5)，以得出單個催化步驟的單一速率和平衡常數以及激活焓項(圖4C)。同樣重要的是，兩種不同的方法得到的參數，傳統的解析拟合和整體數值積分，顯示出高度的一緻性，進而提供了一個重要的訓示所提出的動力學模型的