大家好，今天推送的文章是2024年5月發表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上的“Tailor-Made α‑Glucans by Engineering the Processivity of α‑Glucanotransferases via Tunnel-Cleft Active Center Interconversions”，通訊作者為江南大學的柏玉香研究員。
多糖的功能與其大小密切相關，這在很大程度上取決于負責合成的轉移酶的持續合成能力。隧道活性中心結構已被認為是控制多種糖苷水解酶（GH）（例如纖維素酶和幾丁質酶）持續合成能力的關鍵因素。在 GH70 家族的 羅伊氏檸檬酸乳杆菌 121 GtfB (Lr121 GTfB) α-葡聚糖轉移酶中也觀察到類似的隧道結構。支援這些轉葡糖基酶持續合成能力的分子元件仍未得到充分探索。
本文作者團隊報告了來自羅伊氏乳杆菌 N1 (LrN1 GtfB) 的新型 4,6-α-葡聚糖轉移酶合成了散布有線性和支鍊 (α1 → 6) 連接配接的最小 (α1 → 4)α-葡聚糖，它具有開裂活性中心而不是隧道結構。基于 LrN1 GtfB 和 Lr121 GtfB 晶體結構的環交換工程闡明了供體亞位點 -2 至 -3 處環介導的隧道/裂口結構對這些 α-葡聚糖轉移酶的持續合成能力的影響，進而能夠定制産品尺寸和基材偏好。
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GtfB α-葡萄糖轉移酶活性中心的構象比較
作者團隊之前的工作中從羅伊氏乳杆菌N1（LrN1 GtfB）中鑒定出一種新的GtfB酶，該酶具有高酶活性和異源表達的可溶性蛋白産量。LrN1 GtfB 表現出 4,6-α-葡聚糖轉移酶 II 活性，能夠合成散布在 （α1 → 4）-葡聚糖鍊中的線性和支鍊 （α1 → 6） 鍵。此外，LrN1 GtfB的晶體結構提供了關于其活性中心構象的更清晰的資訊。如圖1所示，羅伊氏乳杆菌NCC 2613 GtfB（Lr2613 GtfB），LrN1 GtfB 和 Lf2970 GtfB 的 AlphaFold 模型顯示，位于酶供體亞位點的環 A1 和 B 太短，無法形成在 Lr121 GtfB 活性中心觀察到的隧道。是以，LrN1 GtfB表現出相對開放的底物結合槽，其開放性介于Lr2613 GtfB和Lf2970 GtfB之間。相比之下，由于 A1（17 個殘基）和 B（20 個殘基）的環較長，Lr121 GtfB 中活性中心的構象與其他三種酶不同。在 Lr121 GtfB 中，環 A1 向結構域 B 形成一個大凸起，而環 B 從相反方向折疊在結合槽上。這兩個環充當“蓋子”，覆寫供體亞位點 -2 至 -3 并形成隧道狀結構，導緻活性中心不太開放。
圖 1
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LrN1 GtfB和不同底物産物的分子質分布
如圖2 所示，作者團隊通過HPGPC測定用麥芽庚糖（G7）/直鍊澱粉/支鍊澱粉孵育的LrN1 GtfB産物的平均分子量分布分别為1.9、3.0和2.9 kDa。是以，在LrN1 GtfB中觀察到廣泛的底物特異性，能夠對直鍊澱粉和支鍊澱粉表現出相當大的修飾作用，由于活性中心相對開放，與Lr2613 GtfB相似。此外LrN1 GtfB的修飾顯著降低了直鍊澱粉和支鍊澱粉的分子量，表明LrN1 GtfB對這些高分子量底物具有強大的内溶活性，導緻底物分子量顯著降低。然後，它完成了（α1→6）轉葡糖基化過程，增加了α-葡聚糖産物中（α1→6）鍵的比例。
圖 2
是以，LrN1 GtfB從直鍊澱粉中産生了最小的羅伊特鍊類α-葡聚糖，這在迄今為止由表征的GtfB同系物合成的産物中尚未觀察到 (圖3）。值得注意的是，Lr121 GtfB從直鍊澱粉中産生了分子量高達15 kDa的線性IMMP。
圖 3
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LrN1 GtfB環工程突變體的建構
與AlphaFold模型
作者團隊通過比較結構和功能分析強調了在GH70 GtfB α-葡聚糖轉移酶的進化過程中，活性中心供體側的環與α-葡聚糖大小之間的相關性。為了研究這些環對 LrN1 GtfB 中産物譜的影響，作者團隊對 LrN1 GtfB 中供體亞位點的 A1（殘基 384-393）和 B（殘基 169-176）環進行了合理的替換。使用 LrN1 GtfB 作為“親本”酶，三個環工程突變體 （LrN1 GtfB121loop, LrN1 GtfB2970loop, and LrN1 GtfB2613loop）是通過将LrN1 GtfB中環A1和B的序列片段與三種代表性GtfB酶的序列片段交換而産生的。如圖4所示，突變體LrN1 GtfB2613loop和LrN1 GtfB2970loop中環A1和B的長度非常接近野生型Lr N1 GtfB的長度。是以，這兩個突變體的活性中心構象與野生型酶沒有顯着差異，并保持相對開放的結構。然而，AlphaFold 模型中 LrN1 GTfB121loop 突變體中的長環成功地有助于形成類似于 Lr121 GTfB 中觀察到的隧道結構（圖 1）。
圖4
作者團隊對三個環工程突變體進行了生化表征，以研究由環 A1 和 B 介導的隧道結構對 GtfB α-葡聚糖轉移酶合成能力的影響。這些環工程變體的酶活性與野生型LrN1 GtfB相似，甚至略高于野生型LrN1 GtfB，為這些突變體的結構完整性提供了證據。其中，LrN1 GtfB2970loop的水解活性大約是野生型的五倍，與LrN1 GtfB相比，其轉葡糖基化效率顯著降低。正如預期的那樣，LrN1 GtfB121loop與野生型LrN1 GtfB相比，具有隧道結構的突變體表現出較低的水解活性和較高的轉葡糖基化效率。這可歸因于隧道結構，由位于 -2 至 -3 亞位點的環 A1 和 B 形成，有助于屏蔽溶劑并降低水解效應，這更有利于轉葡萄糖基化反應。
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LrN1 GtfB環工程突變體産物的表征
LrN1 GtfB121loop, LrN1 GtfB2970loop, and LrN1 GtfB2613loop 與直鍊澱粉孵育的産物中 （α1 → 6）鍵比例中分别占29%、30%和28%，這與在LrN1 GtfB（28%）的産品中觀察到的幾乎相同。是以1H NMR 結果初步排除了環 A1 和 B 在酶鍵特異性中的關鍵作用。此外，HPGPC分析表明，在将LrN1 GtfB環與Lf2970 GtfB和Lr2613 GtfB交換後，直鍊澱粉産物的分子品質沒有顯着差異（圖5），可能反映了這些環替換在LrN1 GtfB的活性中心沒有本質變化。引人注目的是，将 Lr121 GtfB 的較長環模拟物引入 LrN1 GtfB 中，導緻直鍊澱粉的産物大小平均增加近一倍，達到 5.9 kDa，而較短的環變體保留了與野生型酶相似的産物大小（圖 5）。這些發現創新地确立了供體位點環對 LrN1 GtfB 和可能的其他 GtfB 樣 α-葡聚糖轉移酶合成能力的主要貢獻。是以，在不失去原始連鎖特異性的情況下，LrN1 GtfB的合成能力通過供體結合亞位點隧道結構的環工程成功調控。
圖5
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隧道結構 Lr121 GtfB 中的反向環路工程
為了進一步确認隧道結構對這些GtfB α-葡聚糖轉移酶合成能力的影響，并驗證環介導的隧道結構對其廣泛底物特異性的影響，作者團隊進行了反向環工程，通過交換Lr121 GtfB的隧道形成環A1（殘基1139-1151，Lr121 GtfB編号）和B（殘基905-924，Lr121 GtfB編号）（圖6）與相應的 LrN1 GtfB 較短的環路，以破壞隧道架構。
如圖 6 所示，在野生型 Lr121 GtfB 中，環 A1 和 B 在供體亞位點 −2 至 −3 處協同形成隧道結構。但是，Lr121 GtfBN1loop 的 AlphaFold 模型在活性中心表現出相對開放的裂隙構象，與在野生型Lr121 GtfB中觀察到的隧道完全不同。無隧道結構的 Lr121 GtfBN1loop 的水解活性相對于野生型增強，轉糖基化/水解 （T/H） 比值降低。在Lr121 GtfB中觀察到相反的變化。是以，隧道結構确實能夠促進持續的轉葡萄糖基化并抑制水解。
圖 6
由直鍊澱粉或支鍊澱粉通過Lr121 GtfBN1loop 合成的産物混合物與野生型Lr121 GtfB相比，分子量分布分别減少了3倍和8倍（圖7）。是以，結合LrN1 GtfB和Lr121 GtfB的環工程結果可以推斷出由長A1和B環形成的隧道結構是GtfB α-葡聚糖糖轉移酶的主要合成能力決定因素。
圖 7
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供體位點環沿 GtfB α-葡萄糖轉移酶的
進化途徑賦予底物和産物的多樣化
為了深入了解與供體位點環相關的催化變化，作者團隊測量了 LrN1 GTfB、Lr121 GTfB 及其針對直鍊澱粉和支鍊澱粉的環工程變體的動力學參數，發現隧道結構的廢除使酶再次具有廣泛的底物特異性。對 503 個推定的 GtfB 蛋白的系統發育樹的分析表明，大多數 （82.7%） 的 GtfB 序列預計具有由高度保守的 17 個和 20 個殘基的較長 A1 和 B 環形成的隧道結構（圖 8）。值得注意的是，隻有 17.3% 的序清單現出獨特的較短環 A1 和 B。在其餘序列中，這些環的縮短暗示了開裂結構。具有隧道結構的GtfB酶與具有開裂結構的GtfB酶之間的進化關系無法從系統發育分析中最終确定。然而，可以推斷出持續合成能力是由這些 GtfB α-葡聚糖轉移酶中環的進化引起的。隧道結構的存在有助于提高轉葡糖基化效率和合成能力。然而這種增強是以基材多樣性降低為代價的。
圖 8
本文研究為 GH70 α-葡聚糖轉移酶的持續合成能力決定因素和進化多樣化提供了前所未有的見解，并為工程澱粉轉化 α-葡聚糖轉移酶提供了一種簡單的途徑以産生用于不同生物技術應用的多種 α-葡聚糖。
文章資訊：
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c01842