大家好，今天推送的文章是2024年5月发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上的“Tailor-Made α‑Glucans by Engineering the Processivity of α‑Glucanotransferases via Tunnel-Cleft Active Center Interconversions”，通讯作者为江南大学的柏玉香研究员。
多糖的功能与其大小密切相关，这在很大程度上取决于负责合成的转移酶的持续合成能力。隧道活性中心结构已被认为是控制多种糖苷水解酶（GH）（例如纤维素酶和几丁质酶）持续合成能力的关键因素。在 GH70 家族的 罗伊氏柠檬酸乳杆菌 121 GtfB (Lr121 GTfB) α-葡聚糖转移酶中也观察到类似的隧道结构。支持这些转葡糖基酶持续合成能力的分子元件仍未得到充分探索。
本文作者团队报告了来自罗伊氏乳杆菌 N1 (LrN1 GtfB) 的新型 4,6-α-葡聚糖转移酶合成了散布有线性和支链 (α1 → 6) 连接的最小 (α1 → 4)α-葡聚糖，它具有开裂活性中心而不是隧道结构。基于 LrN1 GtfB 和 Lr121 GtfB 晶体结构的环交换工程阐明了供体亚位点 -2 至 -3 处环介导的隧道/裂口结构对这些 α-葡聚糖转移酶的持续合成能力的影响，从而能够定制产品尺寸和基材偏好。
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GtfB α-葡萄糖转移酶活性中心的构象比较
作者团队之前的工作中从罗伊氏乳杆菌N1（LrN1 GtfB）中鉴定出一种新的GtfB酶，该酶具有高酶活性和异源表达的可溶性蛋白产量。LrN1 GtfB 表现出 4,6-α-葡聚糖转移酶 II 活性，能够合成散布在 （α1 → 4）-葡聚糖链中的线性和支链 （α1 → 6） 键。此外，LrN1 GtfB的晶体结构提供了关于其活性中心构象的更清晰的信息。如图1所示，罗伊氏乳杆菌NCC 2613 GtfB（Lr2613 GtfB），LrN1 GtfB 和 Lf2970 GtfB 的 AlphaFold 模型显示，位于酶供体亚位点的环 A1 和 B 太短，无法形成在 Lr121 GtfB 活性中心观察到的隧道。因此，LrN1 GtfB表现出相对开放的底物结合槽，其开放性介于Lr2613 GtfB和Lf2970 GtfB之间。相比之下，由于 A1（17 个残基）和 B（20 个残基）的环较长，Lr121 GtfB 中活性中心的构象与其他三种酶不同。在 Lr121 GtfB 中，环 A1 向结构域 B 形成一个大凸起，而环 B 从相反方向折叠在结合槽上。这两个环充当“盖子”，覆盖供体亚位点 -2 至 -3 并形成隧道状结构，导致活性中心不太开放。
图 1
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LrN1 GtfB和不同底物产物的分子质分布
如图2 所示，作者团队通过HPGPC测定用麦芽庚糖（G7）/直链淀粉/支链淀粉孵育的LrN1 GtfB产物的平均分子量分布分别为1.9、3.0和2.9 kDa。因此，在LrN1 GtfB中观察到广泛的底物特异性，能够对直链淀粉和支链淀粉表现出相当大的修饰作用，由于活性中心相对开放，与Lr2613 GtfB相似。此外LrN1 GtfB的修饰显著降低了直链淀粉和支链淀粉的分子量，表明LrN1 GtfB对这些高分子量底物具有强大的内溶活性，导致底物分子量显著降低。然后，它完成了（α1→6）转葡糖基化过程，增加了α-葡聚糖产物中（α1→6）键的比例。
图 2
因此，LrN1 GtfB从直链淀粉中产生了最小的罗伊特链类α-葡聚糖，这在迄今为止由表征的GtfB同系物合成的产物中尚未观察到 (图3）。值得注意的是，Lr121 GtfB从直链淀粉中产生了分子量高达15 kDa的线性IMMP。
图 3
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LrN1 GtfB环工程突变体的构建
与AlphaFold模型
作者团队通过比较结构和功能分析强调了在GH70 GtfB α-葡聚糖转移酶的进化过程中，活性中心供体侧的环与α-葡聚糖大小之间的相关性。为了研究这些环对 LrN1 GtfB 中产物谱的影响，作者团队对 LrN1 GtfB 中供体亚位点的 A1（残基 384-393）和 B（残基 169-176）环进行了合理的替换。使用 LrN1 GtfB 作为“亲本”酶，三个环工程突变体 （LrN1 GtfB121loop, LrN1 GtfB2970loop, and LrN1 GtfB2613loop）是通过将LrN1 GtfB中环A1和B的序列片段与三种代表性GtfB酶的序列片段交换而产生的。如图4所示，突变体LrN1 GtfB2613loop和LrN1 GtfB2970loop中环A1和B的长度非常接近野生型Lr N1 GtfB的长度。因此，这两个突变体的活性中心构象与野生型酶没有显着差异，并保持相对开放的结构。然而，AlphaFold 模型中 LrN1 GTfB121loop 突变体中的长环成功地有助于形成类似于 Lr121 GTfB 中观察到的隧道结构（图 1）。
图4
作者团队对三个环工程突变体进行了生化表征，以研究由环 A1 和 B 介导的隧道结构对 GtfB α-葡聚糖转移酶合成能力的影响。这些环工程变体的酶活性与野生型LrN1 GtfB相似，甚至略高于野生型LrN1 GtfB，为这些突变体的结构完整性提供了证据。其中，LrN1 GtfB2970loop的水解活性大约是野生型的五倍，与LrN1 GtfB相比，其转葡糖基化效率显著降低。正如预期的那样，LrN1 GtfB121loop与野生型LrN1 GtfB相比，具有隧道结构的突变体表现出较低的水解活性和较高的转葡糖基化效率。这可归因于隧道结构，由位于 -2 至 -3 亚位点的环 A1 和 B 形成，有助于屏蔽溶剂并降低水解效应，这更有利于转葡萄糖基化反应。
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LrN1 GtfB环工程突变体产物的表征
LrN1 GtfB121loop, LrN1 GtfB2970loop, and LrN1 GtfB2613loop 与直链淀粉孵育的产物中 （α1 → 6）键比例中分别占29%、30%和28%，这与在LrN1 GtfB（28%）的产品中观察到的几乎相同。因此1H NMR 结果初步排除了环 A1 和 B 在酶键特异性中的关键作用。此外，HPGPC分析表明，在将LrN1 GtfB环与Lf2970 GtfB和Lr2613 GtfB交换后，直链淀粉产物的分子质量没有显着差异（图5），可能反映了这些环替换在LrN1 GtfB的活性中心没有本质变化。引人注目的是，将 Lr121 GtfB 的较长环模拟物引入 LrN1 GtfB 中，导致直链淀粉的产物大小平均增加近一倍，达到 5.9 kDa，而较短的环变体保留了与野生型酶相似的产物大小（图 5）。这些发现创新地确立了供体位点环对 LrN1 GtfB 和可能的其他 GtfB 样 α-葡聚糖转移酶合成能力的主要贡献。因此，在不失去原始连锁特异性的情况下，LrN1 GtfB的合成能力通过供体结合亚位点隧道结构的环工程成功调控。
图5
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隧道结构 Lr121 GtfB 中的反向环路工程
为了进一步确认隧道结构对这些GtfB α-葡聚糖转移酶合成能力的影响，并验证环介导的隧道结构对其广泛底物特异性的影响，作者团队进行了反向环工程，通过交换Lr121 GtfB的隧道形成环A1（残基1139-1151，Lr121 GtfB编号）和B（残基905-924，Lr121 GtfB编号）（图6）与相应的 LrN1 GtfB 较短的环路，以破坏隧道架构。
如图 6 所示，在野生型 Lr121 GtfB 中，环 A1 和 B 在供体亚位点 −2 至 −3 处协同形成隧道结构。但是，Lr121 GtfBN1loop 的 AlphaFold 模型在活性中心表现出相对开放的裂隙构象，与在野生型Lr121 GtfB中观察到的隧道完全不同。无隧道结构的 Lr121 GtfBN1loop 的水解活性相对于野生型增强，转糖基化/水解 （T/H） 比值降低。在Lr121 GtfB中观察到相反的变化。因此，隧道结构确实能够促进持续的转葡萄糖基化并抑制水解。
图 6
由直链淀粉或支链淀粉通过Lr121 GtfBN1loop 合成的产物混合物与野生型Lr121 GtfB相比，分子量分布分别减少了3倍和8倍（图7）。因此，结合LrN1 GtfB和Lr121 GtfB的环工程结果可以推断出由长A1和B环形成的隧道结构是GtfB α-葡聚糖糖转移酶的主要合成能力决定因素。
图 7
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供体位点环沿 GtfB α-葡萄糖转移酶的
进化途径赋予底物和产物的多样化
为了深入了解与供体位点环相关的催化变化，作者团队测量了 LrN1 GTfB、Lr121 GTfB 及其针对直链淀粉和支链淀粉的环工程变体的动力学参数，发现隧道结构的废除使酶再次具有广泛的底物特异性。对 503 个推定的 GtfB 蛋白的系统发育树的分析表明，大多数 （82.7%） 的 GtfB 序列预计具有由高度保守的 17 个和 20 个残基的较长 A1 和 B 环形成的隧道结构（图 8）。值得注意的是，只有 17.3% 的序列表现出独特的较短环 A1 和 B。在其余序列中，这些环的缩短暗示了开裂结构。具有隧道结构的GtfB酶与具有开裂结构的GtfB酶之间的进化关系无法从系统发育分析中最终确定。然而，可以推断出持续合成能力是由这些 GtfB α-葡聚糖转移酶中环的进化引起的。隧道结构的存在有助于提高转葡糖基化效率和合成能力。然而这种增强是以基材多样性降低为代价的。
图 8
本文研究为 GH70 α-葡聚糖转移酶的持续合成能力决定因素和进化多样化提供了前所未有的见解，并为工程淀粉转化 α-葡聚糖转移酶提供了一种简单的途径以产生用于不同生物技术应用的多种 α-葡聚糖。
文章信息：
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c01842