大家好，今天为大家带来的文章是2024年2月16发表在ACS Catalysis上的“Bacterial Lactonases ZenA with Noncanonical Structural Features Hydrolyze the Mycotoxin Zearalenone”，通讯作者是帝斯曼-芬美意动物营养与健康研发中心的Wulf-Dieter Moll和布尔诺圣安妮大学医院国际临床研究中心的Zbynek Prokop。
玉米赤霉烯酮(ZEN)是由稻谷镰刀菌和其他植物致病性镰刀菌产生的一种真菌雌激素聚酮。谷物中ZEN的污染是常见的，利用真菌内酯酶对其进行水解解毒已被探索。在这里，作者报道了一株具有ZEN水解活性的Rhodococcus erythropolis PFA D8−1的分离，在线性质粒pSFRL1上克隆了编码α/β水解酶ZenA的基因，并对其9个同源物进行了生化鉴定。此外，作者报道了位点定向诱变和结构分析的R. erythropolis的二聚体和更耐热的Streptomyces coelicoflavus的四聚体（没有结合配体）。x射线晶体结构不仅揭示了α/β水解酶的典型特征，包括Ser-His-Asp催化三元结构域，还揭示了α/β水解酶的不寻常特征，包括不常见的氧阴离子空穴基序和参与四聚体相互作用的外围反平行短β片。ZenARe和ZenAScfl的预稳态动力学分析确定了反应循环的平衡限速步骤，该步骤可随温度而变化。一些新的细菌ZEN内酯酶比已知的真菌ZEN内酯酶具有更低的KM和更高的kcat，可能有助于酶技术的发展，以降解饲料或食品中的ZEN。
- 1. ZEN内酯酶基因的克隆
作者对从土壤中提取的几种细菌混合培养物进行富集培养，结果显示ZEN降解。随后，作者对其进行划线培养以获得单菌落，测试各菌落培养物对ZEN转化活性。分离的PFA D8−1显示出快速和强大的ZEN转化活性，16S rDNA测序鉴定其为R. erythropolis。
先前的研究表明HZEN是PFA D8−1转化ZEN的主要代谢物。经过测定，R. erythropolis DSM 43066T和R. erythropolis PR482对ZEN无水解活性。红孢霉PFA D8−1裂解物也能将ZEN转化为HZEN，但在裂解前需要将生物质暴露于ZEN，并且未诱导的生物质裂解物的活性很低。
对红孢霉的PFA D8−1进行全基因组测序，得到9个覆盖7.08 Mb的测序支架(序列存放于DDBJ/ENA/GenBank a s BioProject PRJNA884193)。其中7个支架与红孢霉PR4基因组吻合良好，但1号和8号支架(共覆盖659 kbp)未显示匹配。红孢霉PFA D8−1 DNA的脉冲场梯度凝胶电泳显示660 kbp处有一条条带。
线性巨质粒是红孢霉的典型特征，通常含有外源药物分解代谢的基因。作者将新的巨质粒命名为pSFRL1，并推测是否有基因能够降解ZEN。作者试图从脉冲场电泳凝胶中分离出pSFRL1 DNA，并将部分消化的pSFRL1 DNA克隆到大肠杆菌-红球菌穿梭载体pMVS301.85中。然而，pSFRL1 DNA的繁琐制备意味着全基因组DNA文库对从分离的pSFRL1 DNA制备的文库进行克隆和功能筛选更加合适。
通过分离基因组DNA，用具有4个碱基对识别位点的限制性内切酶(HinIII)进行部分酶切，并将片段连接到质粒载体pMVS301中，克隆出红孢霉PFA D8−1基因组文库。采用peg介导的原生质体转化方案，将文库转化为红孢霉PR4，每个克隆平均插入11.5 kbp的红孢霉PFA D8−1基因组DNA。通过筛选具有zen水解活性的克隆，鉴定出在pMVS301中插入7781 bp的克隆P1G2。该插入物定位于pSFRL1，包含一个987 bp的ORF (DDBJ/ENA/GenBank登录为OAX51_31155)，预计编码α/β水解酶。将该ORF扩增，插入pET-28a(+)中，转化为大肠杆菌BL21(DE3)和HMS174(DE3)，并验证其具有ZEN水解活性。按照细菌基因命名法的惯例，作者将该基因命名为zenARe。
2.ZenARe的酶学和生物物理特性
ZenARe上的c端6xhis标签对大肠杆菌的酶活性和产量没有影响(数据未显示)，用于制备纯酶。ZenARe在38°C时活性最高(图1A)，该温度下在孵育过程中随时间增加活性下降(图1B)，并且在热荧光法测定的熔化温度范围内(图1C)。在30°C条件下pH 8.2时活性最高，在25°C条件下pH 6.5至pH 10范围内孵育后，ZenARe仍保持活性(图1D)。
图1
序列比对可以预测催化丝氨酸（图2），存在于亲核弯的保守特征基序GXSXG90(在ZenARe中为Ser-128)和催化组氨酸(在ZenARe中为His-303)。为了鉴定催化三联体的酸性残留物，通过定点诱变制备了ZenARe的变体。在ZenARe的Asp-264中，在三联体的酸性残基通常位于的序列范围内，是可能目标。变体D264A, D264L和D264N是具有催化活性的。另一种保守的天冬氨酸也是目标，具有氨基酸交换的酶变体D153A, D153L或D153N均未水解ZEN。因此，ZenARe的催化三元组被定义为Ser-128−His-303−Asp-153。在α/β水解酶中，氧阴离子残基I通常位于催化亲核试剂之后，氧阴离子残基II位于β-3.91之后的环中。然而，氧阴离子残基II的前面通常有一个(GX型)或两个(GGGX型)甘氨酸残基，并且在ZenARe的预测序列区域中没有这样的序列基序。没有酪氨酸残留表明存在y型氧阴离子空洞。
图2
- 3.ZenARe同源物的生化分析
表1所列的14个ZenARe同源物是从BLAST搜索结果中选择的，并在大肠杆菌中使用c端6xHis-tag产生。其中8种酶可以以可溶性形式产生并纯化。它们都催化了ZEN的水解，但测量的动力学参数在很大范围内变化（表1) 。这些序列如图2所示。最佳温度范围为20 ~ 50℃，最佳pH值范围为7.0 ~ 8.5。展开温度，由温度斜坡上测量的热荧光荧光强度的拐点确定，范围从38°C到61°C。采用定点诱变的方法靶向了ZenAScfl的催化三残基，S112A、D137A、H286A和H286Y (PDB ID: 8CLP)在大肠杆菌中表达良好，大肠杆菌裂解物的ZEN水解活性较弱，但可检测到。
- 表1
- 4.ZenARe和ZenAScfl的预稳态动力学
作者选择了具有高活性的ZenARe酶和具有高温稳定性的ZenAScfl酶进行预稳态动力学分析，采用停流和淬流方法揭示了ZEN水解的动力学机制，并估计了与各个催化步骤相关的速率和平衡常数。由于生理温度为37℃，反应速度过快，作者使用ZenARe在逐渐降低的温度下进行动力学实验，使其能够精确量化每一步，并对反应热力学有更深入的了解。作者通过传统的分析曲线拟合开始动力学分析，以建立动力学模型，并获得一些速率和平衡常数的初步估计(图3)。在第二步中，常规分析拟合的结果被用作复杂全局数值模型的初始参数(图4和5)。总体而言，动力学分析使用了一个复杂的数据集，包括来自淬流爆发和稳态数据的分子物种绝对浓度的时间分辨信息，以及使用停流荧光方法记录的时间分辨光谱数据。天然色氨酸荧光在不需要标记的情况下提供了所有单个催化步骤的丰富信息。仅用酶和仅用底物进行对照注射，以验证观察到的信号可归因于酶-底物相互作用而不是伪影。
首先在分析数据拟合中确定和量化单个反应物质对荧光信号的贡献(图3)，然后一致地用于构建适当的比例函数进行数值拟合。作者一步一步地描述了如何识别和量化单个荧光贡献，以及如何在支持信息文本“动力学数据分析和统计”中构建用于模拟荧光动力学数据的最终缩放函数。
图3
经过作者上面描述的逐步分析，使得定义一个ZenA催化循环模型成为可能(图4A)，它包括(1)底物结合，(2)诱导构象步骤(酶“闭合”)，(3)第一个化学步骤(中间形成)，(4)第二个化学步骤(中间到产物转化)，(5)构象在之前的酶-产物复合物(酶“打开”)步骤，（6）最后一个产物释放步骤。
图4
作者利用从ZenA动力学模型中导出的速率方程的数值积分，对稳态和准稳态动力学数据进行了全局建模(图4A)。分析拟合的参数被用作全局拟合的起始值。在全局分析中，同时拟合了完整的数据集(图5)，以得出单个催化步骤的单一速率和平衡常数以及激活焓项(图4C)。同样重要的是，两种不同的方法得到的参数，传统的解析拟合和整体数值积分，显示出高度的一致性，从而提供了一个重要的指示所提出的动力学模型的