大家好，今天推送的文章是2024年4月發表在Green Chemistry上的“Biocatalytic asymmetric ring-opening of meso-epoxides to enantiopure cyclic trans-β-amino alcohols involving a key amine transaminase”，通訊作者為太原理工大學生物醫學工程學院的張建棟教授。
生産手性環狀β-氨基醇的傳統方法包括其外消旋體或衍生物的動力學拆分、钌催化的環狀α-氨基酮的對稱氫化、以及锇催化的烯烴不對稱氨基羟基化（方案1）。而内消旋環氧化物的不對稱親核開環被認為是最簡單經濟的方法。盡管開環反應的研究已經取得了重大進展，但仍面臨合成程式複雜、區域選擇性不足、反應條件苛刻、以及需要對映選擇性、複雜的基團保護等問題。
圖1. 含有手性環狀β-氨基醇的活性藥物成分的結構
作者最近報道了通過多酶級聯催化系統将易獲得且廉價的外消旋環氧化物催化區域選擇性和立體定向開環成手性芳基甘氨醇，但這種系統由于缺乏對環α-羟基酮具有高活性和選擇性的ATA，在合成手性環狀β-氨基醇方面的效果有限。接下來作者繼續研究，通過成功鑒定一種新ATA（CepTA），首次使用完全生物催化方法從内消旋環氧化物中進行區域和對映選擇性合成手性環狀β-氨基醇，并通過一鍋級聯生物催化完成了環狀内消旋環氧化物的生物催化不對稱開環。該政策涉及三個連續步驟：環氧化物水解酶（EH）催化内消旋環氧化物水解為(1R,2R)-鄰位二醇，二醇脫氫酶（DDH）催化(1R,2R)-鄰位二醇區域和對映選擇性氧化為(R)-α-羟基酮，以及CepTA催化(R)-α-羟基酮對映選擇性還原胺化為對映富集的環狀β-氨基醇。丙酮酸是通過α-羟基酮和D-Ala之間的轉氨作用産生，并被乳酸脫氫酶（LDH）進一步轉化為乳酸。涉及DDH和LDH的内部級聯系統可以自給自足回收NAD+/NADH。
方案1. 手性環狀β-氨基醇不對稱合成政策
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ATA的篩選
作者首先選擇了将α-羟基酮2'轉化為手性環狀β-氨基醇1'的級聯生物催化第三步中的酶。目前，隻有少數ATA被用于從α-羟基酮合成手性β-氨基醇，但很少有ATA用于從前手性α-羟基酮合成手性環狀β-氨基醇的報道。
作者評估了一些ATA催化(R)-α-羟基環己烷-1-酮2'k轉化為所需手性2-氨基環己醇1'k的潛力，發現來自Capronia epimyces CBS606.96的CepTA對(R)-2'k顯示出顯着活性。該反應生成(1R,2R)-反式-2-氨基環己醇1′k。相比之下，其他ATA對(R)-2'k的活性可以忽略不計（低于1%）。
随後，作者對CepTA進行進一步純化和表征。CepTA對(±)-MBA底物的活性表明其(R)-選擇性轉氨酶活性。然而，當使用(±)-苯基甘氨醇作為底物時，CepTA表現出(S)-選擇性活性。作者計算了酶對不同底物的活性，并探索了酶的耐受pH範圍和溫度。
圖2中表明了CepTA在優化條件下對各種胺和β-氨基醇的特異性。可以看出，CepTA對(R)構型胺表現出較高的活性，而對(S)構型胺沒有活性。此外，CepTA對各種β-氨基醇也表現出高活性，其中對(S)構型線性β-氨基醇和芳香族β-氨基醇具有顯着活性，但對(R)-構型直鍊β-氨基醇和芳香族β-氨基醇沒有活性。該結果凸顯了CepTA作為立體化學選擇性轉化的有價值的生物催化劑的潛力。
圖2. CepTA對多種胺和β-氨基醇的活性
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同源模組化、分子對接和分子動力學模拟
為了探索新鑒定的CepTA的酶結構和催化效率，作者進行了同源模組化、分子對接和分子動力學（MD）模拟。序列分析顯示，CepTA與MVTA14和RbTA20分别具有47%和46%的同一性。CepTA和三種相關蛋白的氨基酸序列比對表明，PLP結合位點、活性位點賴氨酸和推定的(R)選擇性ATA基序非常保守。使用(R)-選擇性胺轉氨酶(PDB ID: 6FTE, 74% 一緻性)和RbTA (PDB ID: 7DBE, 46% 一緻性)的結構建構MvTA和CepTA的同源二聚體模型，采用分子對接将PMP最初定位在MvTA和CepTA内。作者發現CepTA口袋周圍的大多數殘基都是高度保守，關鍵氨基酸（如Arg77、Gly236、Val237、Thr238和Thr274）與磷酸基團形成多個氫鍵或鹽橋，這對于穩定複合物至關重要。MvTA中的Arg93、Ile253、Thr254和Thr290也有類似的穩定作用。
圖3. 分子對接
為了研究CepTa/MvTA對環α-羟基酮底物的底物識别和催化效率，作者将(R)-α-羟基環己烷-1-酮2'k對接到CepTA/MvTA-PMP複合物中，得到初始構象表明親核攻擊。如圖3所示，(R)-2′k在大口袋（O型口袋）中的CepTA和MvTA中具有相似的結合姿勢。作者對每個系統進行MD模拟，兩種複合物的均方根（RMSD）如圖4所示。在兩個系統中第一納秒内觀察到的初始急劇增加可能歸因于無規卷曲的松弛。随後，這兩種複合物具有恒定的分布，作者推測這似乎保持了大緻穩定的模式。
圖4. 兩個配合物的RMSD曲線
對于CepTA複合物，PMP和蛋白質的RMSD略低于MvTA複合物。此外，在MvTA複合物中，(R)-2′k似乎比在CepTA複合物中更容易脫離。是以作者推斷可能是由于較弱的氫鍵、不太有利的疏水互相作用或其組合，使得MvTA的催化口袋不能将底物牢牢固定。相反，CepTA複合物由于更有效的氫鍵或與底物的疏水互相作用增強，可能表現出更強的結合親和力。此外，作者還推斷CepTA催化口袋周圍的氨基酸殘基可能會更好地容納底物，進而有助于形成更穩定的酶-底物複合物，并可能提高該R-胺轉氨酶的催化效率。
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使用大腸杆菌全細胞(CepTA)動力學拆分外消旋胺和β-氨基醇
接下來，作者使用全細胞對各種外消旋胺和β-氨基醇進行了動力學拆分。實驗結果表明，CepTA具有廣泛的底物譜，可以有效地分解各種胺和β-氨基醇。
圖5. 使用大腸杆菌全動力學解析外消旋胺
圖6. 使用大腸杆菌全細胞動态解析外消旋β-氨基醇
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大腸杆菌全細胞對酮和α-羟基酮進行不對稱還原氨化(CepTA)
作者選擇了四種不同的酮和八種不同的α-羟基酮作為CepTA 的底物（圖7）來進一步研究還原胺化反應的潛力。
圖7. 大腸杆菌(CepTA)對前手性酮和α-羟基酮進行不對稱還原胺化
結果表明CepTA具有顯着的底物特異性，可對各種酮和α-羟基酮底物進行不對稱還原胺化，尤其對α-羟基酮底物表現出優異的活性和選擇性。這是首次證明了環狀α-羟基酮2′j–k成功實作不對稱還原胺化，進而合成了對映體過量的相應手性環狀β-胺醇1′j–k。
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環狀内消旋環氧化物一鍋級聯生物轉化為手性環狀β-氨基醇
方案2. 環狀内消旋環氧化物不對稱開環生成手性環狀β-氨基醇的級聯生物催化
然後，作者建立了一個四酶、一鍋級聯催化系統（方案2）。作者選擇了三種額外的酶：環氧化物水解酶(SpEH)、氧化酶(AnDDH)和乳酸脫氫酶(BsLDH)，并使用D-Ala作為轉氨酶反應的胺供體。通過使用AnDDH的第二步和使用BsLDH的最後一步，獲得了NAD+/NADH循環再生系統。
表1.
此外，作者通過将大腸杆菌(SpEH-AnDDH-LDH)和大腸杆菌(CepTA)的靜息細胞組合，使用底物4'k制備出(1R,2R)-trans-1'k，ee大于99%，産率為55.8%。