今天推送的文章發表在Green Chemistry的“Engineering the substrate preference of glucose oxidase for the enzymatic oxidation of xylose”，通訊作者為山東大學微生物技術國家重點實驗室的劉國棟副教授。
葡萄糖氧化酶（GOx，EC 1.1.3.4）被廣泛應用于葡萄糖監測、食品和飼料添加、生物燃料電池的建構等。d-木糖是半纖維素的主要成分，是植物生物量中含量第二豐富的糖。d-木糖的有效轉化是利用木質纖維素原料的關鍵。與GOx廣泛用于檢測和生物轉化d-葡萄糖不同，使用氧作為電子受體有效催化d-木糖氧化為d-木糖-1,5-内酯的酶尚未報道。黑曲黴GOx（AnGOx）對d-木糖的活性比對d-葡萄糖低270倍。通常用使用過量的AnGOx氧化d-木糖，這對于工業過程來說是昂貴的。許多糖脫氫酶也具有在C1位氧化d-木糖的能力，并已用于開發d-木糖生物傳感器或生産d-木糖酸鹽。然而，脫氫酶對氧以外的電子受體的依賴性需要使用全細胞作為催化劑或開發電子受體-再生系統，這增加了其應用的複雜性和成本。
在本研究中，作者使用半理性設計法對AnGOx的底物特異性進行了工程設計，使其對d-木糖的活性提高了5.7倍。進行分子動力學（MD）模拟以探索突變體對d-木糖親和力增強的潛在機制。此外，作者利用AnGOx雙突變體從玉米芯水解物中同時生産木酸鈉和葡萄糖酸鈉。這項研究加深了對GOx底物特異性的了解，并為從木質纖維素生物質中生産木酸鹽提供了一種替代方法。
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篩選對d-木糖活性增強的GOx突變體
由于通過X射線衍射測定的AnGOx的三維結構不包含底物/産物或其類似物。先前有研究使用MD模拟預測了d-葡萄糖和AnGOx活性位點口袋中氨基酸殘基之間的密集互相作用。這些互相作用後來通過将AnGOx的結構疊加到與氧化産物LGC（PDB:4YNU）複合的黃曲黴葡萄糖脫氫酶（AfGDH）上而得到支援。考慮到AfGDH對d-木糖表現出相對較高的活性（約為d-葡萄糖活性的20%），作者根據其活性位點結構與AfGDH的比較對AnGOx進行工程設計。分别對底物結合口袋周圍的10個殘基（T110A、N217S、R176S、F215Y、Q347S、F351Y、D416H、F414L、D424E和T331N）進行定點誘變，并在釀酒酵母中表達突變體。活性測量顯示，沒有一個突變體對d-木糖表現出增加的活性。這些結果表明，AnGOx和AfGDH之間底物特異性差異的潛在機制可能涉及多個殘基的變化。
然後，作者将重點放在活性位點中與d-葡萄糖的C6羟甲基互相作用的殘基上（圖1A）。根據疊加在AfGDH-LGC複合物上的結構，AnGOx的T110可以通過氫鍵與d-葡萄糖的C6–OH基團互相作用（圖1B）。是以，選擇T110使用簡并NNK密碼子進行飽和誘變。用d-果糖作為碳源培養表達AnGOx突變體的釀酒酵母轉化體，以避免d-葡萄糖氧化的任何幹擾，并收集培養上清液用于d-木糖氧化酶活性測定（圖1C）。與表達野生型（WT）AnGOx的轉化子相比，表達T110V和T110I突變體的轉化子對d-木糖的活性顯著增加。由于靶蛋白的表達水準在不同的釀酒酵母轉化體之間可能不同，這可能幹擾酶活性的比較。除了T110，F414與C6位置的羟基非常接近。是以，對T110V突變體的F414殘基進行第二輪飽和誘變。96個轉化體中有6個轉化體對d-木糖的活性明顯高于表達親本突變體T110V的轉化體。這6個轉化子均為F414L突變，使該位置與AfGDH（L401）的位置相同。
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底物特異性改變的AnGOx突變體的特性研究
AnGOx及其突變體在釀酒酵母中的低表達水準不足以進行其表征和應用。作者改用畢赤酵進行表達并純化。T110I、T110V和T110V/F414L對d-木糖的氧化活性分别是WT的0.6倍、1.2倍和5.7倍（表1）。相反，F414L單一突變體的d-木糖氧化酶活性與WT相似。是以，F414L突變對d-木糖氧化活性的影響取決于T110V突變。相對于WT，T110I、T110V和T110V/F414L在天然底物d-葡萄糖上的活性分别降低了96.2%、87.0%和94.4%，這表明在工程中存在選擇性-活性權衡。對于T110V/F214L，d-木糖的比活性是葡萄糖的1.4倍，而對d-果糖、d-甘露糖、d-半乳糖和l-阿拉伯糖的活性幾乎無法檢測到（圖2A）。是以，突變體對測試的單糖保持了立體選擇性。
動力學參數表明（表2），WT對d-木糖的Km值是T110V的1.5倍，T110V/F414L的4.8倍，表明突變體對d-木糖具有更高的底物親和力。然而，兩個突變體的周轉數（kcat）均顯著下降。推測T110V和T110V/F414L對d-木糖的活性增加主要是由它們對底物的親和力增加引起的。另外與野生型相比，兩種突變體對d-葡萄糖氧化的kcat/Km降低，這歸因于底物親和力降低和周轉數減少。這些結果表明，突變擴大了AnGOx的底物範圍，但代價是降低了産物産率。
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分子動力學模拟
d-木糖和d-葡萄糖結構之間的唯一差別是d-木糖中缺乏外環羟甲基。為了了解d-木糖氧化酶活性提高的潛在機制，作者采用AnGOx、T110V和T110V/F414L與d-木糖的複合物進行全原子MD模拟。RMSD顯示，除WT外，所有系統在100ns模拟過程中都達到了平衡狀态，表明這些突變促進了d-木糖與酶的穩定結合。RMSF值的變化顯示突變不影響底物結合口袋中殘基的靈活性。然後，作者研究了d-木糖的O1原子與關鍵的兩個組氨酸催化殘基（H516和H559）之間的距離。與WT相比，在T110V中，d-木糖的O1更接近H516，在T110V/F414L中，其與兩個組氨酸殘基的距離值更低（圖3A–C）。在T110V/F414L的構象中，91.6%的O1木糖–H516距離<7.0Å，86.2%的O1二甲苯–H559距離<9.0Å。這些頻率明顯高于WT（分别為24.7%和39.0%）。
為了詳細了解d-木糖和活性位點之間的互相作用，在模組化的AnGOx-LGC複合物中，選擇了距離LGC 6Å距離内的10個殘基（圖3D），并計算了它們在模拟過程中與d-木糖的互相作用能。與H516和H559的靜電和疏水互相作用在兩個突變體中都得到了增強（圖3E和F）。此外，與H516相鄰殘基，如N514和R512的靜電互相作用增強。相反，與Y68的靜電互相作用和與主導了d-木糖與活性位點結合的F/L414、Y68、G108和T/V110的疏水互相作用在突變體中都減少了（圖3F）。MD模拟過程中産生的構象也表明了活性位點中d-木糖的不同結合模式。在WT中，d-木糖通過其吡喃糖環上的羟基與Y68和T110之間的各種互相作用以及與F414的疏水性互相作用與位于底物結合口袋開口處的位點B結合，将d-木糖拉離口袋深處的催化殘基H516和H559以及的FAD（圖3G）。是以，盡管底物進入通道足夠寬以容納d-木糖，但對d-葡萄糖的穩定很重要的T110和F414對于較小尺寸的底物的正确定位變得不利。由于T110和F414的互相作用在突變體中被破壞，d-木糖與位點a互相作用的機會更大，這使其C1羟基能夠進入催化組氨酸殘基和FAD以啟動反應（圖3H和I）。然而僅通過位點A處的殘基穩定d-木糖增加了底物的運動自由度，并可能導緻突變體的低催化效率（表2）。
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T110V/F414L共轉化d-葡萄糖和d-木糖為醛糖酸
當用作水泥和混凝土添加劑時，木磺酸鹽（木酸鹽）表現出與葡萄糖酸鹽類似的性質，具有巨大的市場潛力。此外，d-木糖酸是合成幾種衍生物（如1，2，4-丁三醇和1，4-丁二醇）的中間分子，并被認為是由生物物質産生的增值平台化學物質。是以，作者測試了具有改善d-木糖氧化活性的T110V/F414L突變體從d-木糖和d-葡萄糖共生産木糖和葡萄糖酸鹽的能力。反應在具有受控pH和連續曝氣的生物反應器中進行。向系統中加入過氧化氫酶以消除有毒産物H2O2。LC-MS分析顯示，使用純d-木糖和d-葡萄糖的混合物作為底物，通過催化制備木酸鹽和葡萄糖酸鹽。
随後，将含有d-木糖和d-葡萄糖的玉米芯水解産物（木質纖維素衍生産物）用作酶促生産醛糖酸鹽的底物（圖5A）。與使用純d-木糖和d-葡萄糖作為底物的反應不同，需要再次添加氧化酶和過氧化氫酶以保持連續反應，這表明水解産物中存在酶抑制化合物。反應48h後，d-木糖和d-葡萄糖的轉化率分别為76.8%和100%（圖5B）。結果表明，具有擴大底物範圍的工程化AnGOx具有用于從木質纖維素材料中酶促生産醛糖酸的潛力。然而，由于周轉數較低，突變體在高底物濃度下可能會失去其優勢（表2）。