今天推送的文章是2023年發表在Chinese Journal of Catalysis上的 “Precise regulation of the substrate selectivity of Baeyer-Villiger monooxygenase to minimize overoxidation of prazole sulfoxides”，通訊作者是許建和教授、郁惠蕾教授和王斌舉教授。
拜爾-維利格單加氧酶(BVMO)能催化硫醚的不對稱氧化生成有價值的手性亞砜，但亞砜的過氧化生成不需要的砜類化合物限制了 BVMO 的合成應用。這種過氧化是由于 BVMO 的底物選擇性不足造成的，在這種情況下，所需的産物亞砜可以被進一步氧化。本研究建立了一個數學模型，根據硫醚和亞砜之間的特異性常數(kcat/Km)的比值，定量地确定底物的選擇性。采用結構導向的底物隧道工程方法，成功地最小化了亞砜過氧化反應，精确地調節了底物選擇性。分子動力學模拟和量子力學/分子力學研究表明，圍繞黃素過氧化氫(FADH-OOH)改變的 H 鍵網絡可以調節亞砜氧化的機制和活性。此外，重新設計的 AcPSMO 突變體已成功應用于其他手性亞砜的可控合成。
建立定量模型來表征 BVMO 在硫醚和亞砜之間的底物選擇性
之前一些研究已經證明了BVMOs的底物選擇性。由于砜的含量不僅取決于亞砜的酶促氧化效率，還受反應過程中不斷變化的亞砜濃度的影響，是以在一定的反應時間内，BVMOs對硫醚氧化的底物選擇性并不能很好地定義。本文通過動力學分辨率中的對映體比(E)建立了表征AcPSMO對硫醚和亞砜選擇性的定量參數
在AcPMSO催化的連續氧化反應(方案1)中，第一底物(硫醚，S1)和第二底物(亞砜，也是第一底物氧化的産物，P1)的濃度是互相關聯的變化。首先，建立了硫醚和亞砜連續氧化的動力學模型。硫醚和亞砜的氧化反應速率用穩态動力學(方程)測定。S1-S3 (SI)。亞砜濃度的變化可以通過從硫醚氧化産生的亞砜中減去進一步氧化的亞砜消耗量來計算。亞砜與硫醚的氧化反應速率之比(ν2/ν1)可寫成式(1)，并進一步簡化為将亞砜與硫醚的kcat/Km比值定義為R (SI中公式(1)。
對式(1)積分得到定量模型(式(2))，在已知硫化物轉化率(c)和産物純度(pp)的情況下，可以在反應過程中任意時刻計算R值。由于這些假設在反應過程中并不總是滿足，将計算得到的R值稱為表觀R值(Rapp)，用它來表示AcPMSO在後續定向進化過程中的底物選擇性。
AcPSMO底物選擇性的結構導向工程
通過共結晶測定了與 FAD 和 NADP+ 複合的 AcPSMO 的晶體結構。與已知的 BVMO 催化循環相比，發現确定的結構是相應的 CHMO 的“close”形式，這與非催化狀态下的結構一緻。然而，無論是通過浸泡實驗還是共結晶實驗，都未能獲得 AcPSMO-FAD-NADP+與底物的配合物。以AcPSMO結構和另一種CHMO的晶體結構為輸入模闆，通過多模闆同源性模組化建構了複合物，該CHMO的晶體結構被确定為催化開放态。由于鄰近底物隧道的氨基酸殘基位置已被報道将底物偏好從環己酮轉移到龐大的底物拉唑亞砜 ，是以推測底物隧道中的殘基也可能影響類似底物奧美拉唑硫醚和(S)-奧美拉唑之間的識别或選擇性。
AcPSMO催化硫化物氧化的底物化學選擇性定量測定依賴于高效液相色譜法，不适合大量突變體的篩選。為了提高識别控制AcPSMO化學選擇性熱點的成功率，結合奧美拉唑硫醚底物空間位阻大、疏水性強的特點，選擇疏水性小的氨基酸缬氨酸代替底物隧道周圍4 Å範圍内的6個殘基，作為對經典丙氨酸掃描政策的優化（圖1)。位于底物通道瓶頸的兩個殘基F277和L432對硫化物和亞砜之間的底物選擇性有明顯的影響。與AcPSMO (Rapp = 12.6)相比，變體F277V的底物選擇性顯著提高(Rapp = 170)，變體L432V的底物選擇性大大降低(Rapp = 1.44)，而這個小文庫中的其他變體在底物選擇性上的差異較小。是以，分别建構位點277和432的飽和突變文庫進行進一步研究。結果表明，除277位點的苯丙氨酸外，所有具有疏水殘基的變異均優于野生型(WT)，其中變體F277L在反應轉化率(91.8%)和底物選擇性(Rapp = 430)方面均表現優異。與此同時，L432X的所有變體都表現出相似或更差的底物選擇性，甚至不同的對映體選擇性。
F277突變體減少亞砜過氧化反應
不同底物選擇性的AcPSMO (WT、L432V和F277L)催化了奧美拉唑硫醚的酶促氧化反應，比較了反應過程中産物(S)-奧美拉唑和不需要的砜副産物的可變積累(圖2)。對于AcPSMO和陰性變體L432V(底物選擇性較低)，24 h後生物亞砜化反應中的砜含量超過65%。主要由(S)-奧美拉唑的生物轉化速率決定(圖2，黑線)。對于底物選擇性最高的陽性變體F277L，其副産物(砜)的積累要少得多，整個反應過程中砜的含量始終小于1%。在這種情況下，積累的(S)-奧美拉唑的最大含量在24 h時增加到97%，這大大提高了手性亞砜的收率，并大大簡化了從含有相似理化性質的副産物的反應混合物中純化(S)-奧美拉唑的過程。
AcPSMO 及其變體對奧美拉唑硫醚和(S)-奧美拉唑氧化的動力學研究
進一步研究了AcPSMO和兩種典型變體(F277L和L244V)對奧美拉唑硫醚和(S)-奧美拉唑的表觀動力學 (表2)。以奧美拉唑硫醚為底物的催化特異性常數(kcat/Km)随突變體的不同而略有變化。突變對AcPSMO對奧美拉唑硫醚的親和力沒有顯著影響，但增強了催化轉換率(kcat)，因為兩種突變都将大型的苯丙氨轉換為較小的缬氨酸，這可能導緻更好地适應奧美拉唑硫醚的進入。有趣的是，對于(S)-奧美拉唑氧化，F277的催化能力幾乎被消除，與AcPSMO野生型酶相比，其催化常數(kcat/Km)僅為6.7%。相比之下，單突變體L432V表現出顯著改善的kcat，并且與(S)-奧美拉唑的結合親和力更高。結果表明，F277L的Rapp值的提高主要是由于對(S)-奧美拉唑的催化效率降低，特别是對期望産物(S)-奧美拉唑的過氧化速率減緩。
通過分子動力學模拟和 QM/MM 計算闡明底物特異性機制
CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反應的機制包括NADPH還原活性部位的FAD，還原後的E-FADH2與氧反應形成c4a-氧合黃素，黃素作為親核試劑攻擊親電底物酮，産物和NADP+釋放。據報道，Baeyer-Villiger氧化反應的NADP+釋放過程是限速的，其速率常數為~ 2 s−1。當底物變成非天然的甲基苯基硫醚和拉唑亞砜時，總反應速率大大降低，限速步驟變為c4a-氧合黃素氧化硫醚的不同步驟。
為了确定AcPSMOs在兩種非天然底物(硫醚和亞砜)之間的固有選擇性的結構基礎，測定了L432V和F277L的晶體結構。根據晶體結構，将硫醚或亞砜對接到AcPSMO WT, L432V和F277L變體中。然後，結合分子動力學(MD)模拟和QM/MM計算，闡明了WT、L432V和F277L AcPSMO變體對硫醚和亞砜氧化的機理。對于硫醚氧化，計算表明，反應是通過逐漸機制進行的，其中黃素C4a-OOH的遠端OH攻擊硫醚，這與O-O鍵的異裂相結合，導緻S-OH+中間體和C-O-被周圍的氫鍵網絡很好地穩定。計算得到的亞砜化勢壘分别為：WT 14.9 kcal/mol、L432V 11.5 kcal/mol和F277L 11.7 kcal/mol，表明在所有這些變體中，亞砜化在動力學上都是非常有利的。
在L432V、F277L和WT的MD模拟中，亞砜的典型結合構象相似(圖3)，底物的苯并咪唑環與FAD的異噁嗪環形成π -π堆疊互相作用。值得注意的是，在WT和L432V的結構中，F277和R327都能形成π-陽離子互相作用。此外，在WT和L432V中，在黃素過氧化氫(FADH-OOH)和ASP57之間都存在連接配接水(W1)。然而，在F277L的MD模拟過程中，水可以擴散出活性位點，導緻FADH-OOH的遠端H與ASP57之間發生直接的氫鍵互相作用。這主要是因為變體F277L可以在L277和R327之間引起明顯的空間排斥力，進而将W1擠出活性位點。除277位殘基外，432位殘基還能影響苯并咪唑環N1-H與FADH-OOH部分之間的氫鍵互相作用。顯然，L432V和F277L突變都可以顯著改變FADH-OOH周圍的氫鍵網絡，這可能對亞砜氧化的機制和反應活性産生根本性影響。
從變體L432V (RC1)、F277L (RC2)和WT (RC3)的代表性結構出發，通過QM/MM計算進一步研究了亞砜的氧化機理。對于L432V(圖4(a))，FADH-OOH的遠端o原子對亞砜的親電攻擊伴随着O-O的異裂(圖4(a)中的TS1a)。随後，水輔助質子(Hd)從FADH-OOH轉移到Oa (ASP)，質子從N1-H轉移到Op，導緻質子化的ASP57和n1 -去質子化的砜産物(Int1a)。該步驟的計算勢壘為16.2 kcal/mol (RC1a→TS1a)。從Int1a開始，底物中質子(Hn)向N1的轉移與質子從質子化的ASP57向Op的轉移相結合，導緻PC1中砜産物的形成。這一步驟在熱力學和動力學上都是非常有利的，隻有5.6 kcal/mol的小勢壘(Int1a→TS1b)。
作為比較，還研究了亞砜在F277L中的氧化機理(圖4b)。與L432V相比，F277L中的亞砜氧化遵循了FADH-OOH介導的氧化機制，其中FADH-OOH的遠端o原子對亞砜的親電攻擊與O-O異裂和質子(Hd)從遠端Od轉移到近端Op，一步生成砜産物(PC2)。該反應需要相對較高的勢壘，為23.8 kcal/mol(圖4b)。顯然，氫鍵網絡的變化從根本上影響了亞砜的氧化機制。QM/MM計算表明，WT中砜的形成具有20 kcal/mol的中等勢壘，介于突變體F277L (23.8 kcal/mol)和突變體L432V (16.2 kcal/mol)之間。QM/ mm預測的勢壘順序與實驗結果吻合較好。尤其是闡明了氫鍵網絡在調節砜形成反應性中的重要作用。
從上述經典MD模拟和混合QM/MM計算的分析來看，D57對于FADH-OOH介導的亞砜氧化中的質子轉移是必不可少的。為了進一步證明D57的催化作用，将D57替換為非極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。在F277L/D57Q突變體中，亞砜氧化為砜的活性受到很大程度的抑制，而其對奧美拉唑硫醚的活性保持不變。除實驗結果外，還對突變體F277L/D57Q進行了模拟。從代表性結構出發，進行QM/MM計算，研究亞砜氧化機理。FADH-OOH的遠端o原子對亞砜的親電性攻擊伴随着O-O的異裂裂解。同時，FADH-OOH向Ow (W1)的質子轉移與N1-H向Op的質子轉移耦合。由于與D57相比，水是一個相當弱的堿，是以發現該反應在動力學上是非常不利的。這一發現與實驗結果一緻，表明在F277L/D57Q突變體中，亞砜氧化成砜的過程将被很大程度上抑制。是以，D57在亞砜氧化制砜過程中起着至關重要的作用。
AcPSMO用于其它奧美拉唑硫醚不對稱氧化的重新設計
在F277L/D57Q催化氧化奧美拉唑硫醚的過程中，相應的砜含量進一步降低。AcPSMO及其變體F277L和F277L/D57Q還對另外三種類似底物進行了氧化測試。突變體F277L和F277L/D57Q顯著降低了所有測試底物的過氧化，尤其均顯著降低了副産物砜的含量，同時所有底物的底物選擇性(Rapp)均有所提高(表3)。表明基于AcPSMO的底物選擇性調控機制設計的突變體成功應用于其他手性拉唑亞砜的可控合成。