今天推送的文章是2023年发表在Chinese Journal of Catalysis上的 “Precise regulation of the substrate selectivity of Baeyer-Villiger monooxygenase to minimize overoxidation of prazole sulfoxides”，通讯作者是许建和教授、郁惠蕾教授和王斌举教授。
拜尔-维利格单加氧酶(BVMO)能催化硫醚的不对称氧化生成有价值的手性亚砜，但亚砜的过氧化生成不需要的砜类化合物限制了 BVMO 的合成应用。这种过氧化是由于 BVMO 的底物选择性不足造成的，在这种情况下，所需的产物亚砜可以被进一步氧化。本研究建立了一个数学模型，根据硫醚和亚砜之间的特异性常数(kcat/Km)的比值，定量地确定底物的选择性。采用结构导向的底物隧道工程方法，成功地最小化了亚砜过氧化反应，精确地调节了底物选择性。分子动力学模拟和量子力学/分子力学研究表明，围绕黄素过氧化氢(FADH-OOH)改变的 H 键网络可以调节亚砜氧化的机制和活性。此外，重新设计的 AcPSMO 突变体已成功应用于其他手性亚砜的可控合成。
建立定量模型来表征 BVMO 在硫醚和亚砜之间的底物选择性
之前一些研究已经证明了BVMOs的底物选择性。由于砜的含量不仅取决于亚砜的酶促氧化效率，还受反应过程中不断变化的亚砜浓度的影响，因此在一定的反应时间内，BVMOs对硫醚氧化的底物选择性并不能很好地定义。本文通过动力学分辨率中的对映体比(E)建立了表征AcPSMO对硫醚和亚砜选择性的定量参数
在AcPMSO催化的连续氧化反应(方案1)中，第一底物(硫醚，S1)和第二底物(亚砜，也是第一底物氧化的产物，P1)的浓度是相互关联的变化。首先，建立了硫醚和亚砜连续氧化的动力学模型。硫醚和亚砜的氧化反应速率用稳态动力学(方程)测定。S1-S3 (SI)。亚砜浓度的变化可以通过从硫醚氧化产生的亚砜中减去进一步氧化的亚砜消耗量来计算。亚砜与硫醚的氧化反应速率之比(ν2/ν1)可写成式(1)，并进一步简化为将亚砜与硫醚的kcat/Km比值定义为R (SI中公式(1)。
对式(1)积分得到定量模型(式(2))，在已知硫化物转化率(c)和产物纯度(pp)的情况下，可以在反应过程中任意时刻计算R值。由于这些假设在反应过程中并不总是满足，将计算得到的R值称为表观R值(Rapp)，用它来表示AcPMSO在后续定向进化过程中的底物选择性。
AcPSMO底物选择性的结构导向工程
通过共结晶测定了与 FAD 和 NADP+ 复合的 AcPSMO 的晶体结构。与已知的 BVMO 催化循环相比，发现确定的结构是相应的 CHMO 的“close”形式，这与非催化状态下的结构一致。然而，无论是通过浸泡实验还是共结晶实验，都未能获得 AcPSMO-FAD-NADP+与底物的配合物。以AcPSMO结构和另一种CHMO的晶体结构为输入模板，通过多模板同源性建模构建了复合物，该CHMO的晶体结构被确定为催化开放态。由于邻近底物隧道的氨基酸残基位置已被报道将底物偏好从环己酮转移到庞大的底物拉唑亚砜 ，因此推测底物隧道中的残基也可能影响类似底物奥美拉唑硫醚和(S)-奥美拉唑之间的识别或选择性。
AcPSMO催化硫化物氧化的底物化学选择性定量测定依赖于高效液相色谱法，不适合大量突变体的筛选。为了提高识别控制AcPSMO化学选择性热点的成功率，结合奥美拉唑硫醚底物空间位阻大、疏水性强的特点，选择疏水性小的氨基酸缬氨酸代替底物隧道周围4 Å范围内的6个残基，作为对经典丙氨酸扫描策略的优化（图1)。位于底物通道瓶颈的两个残基F277和L432对硫化物和亚砜之间的底物选择性有明显的影响。与AcPSMO (Rapp = 12.6)相比，变体F277V的底物选择性显著提高(Rapp = 170)，变体L432V的底物选择性大大降低(Rapp = 1.44)，而这个小文库中的其他变体在底物选择性上的差异较小。因此，分别构建位点277和432的饱和突变文库进行进一步研究。结果表明，除277位点的苯丙氨酸外，所有具有疏水残基的变异均优于野生型(WT)，其中变体F277L在反应转化率(91.8%)和底物选择性(Rapp = 430)方面均表现优异。与此同时，L432X的所有变体都表现出相似或更差的底物选择性，甚至不同的对映体选择性。
F277突变体减少亚砜过氧化反应
不同底物选择性的AcPSMO (WT、L432V和F277L)催化了奥美拉唑硫醚的酶促氧化反应，比较了反应过程中产物(S)-奥美拉唑和不需要的砜副产物的可变积累(图2)。对于AcPSMO和阴性变体L432V(底物选择性较低)，24 h后生物亚砜化反应中的砜含量超过65%。主要由(S)-奥美拉唑的生物转化速率决定(图2，黑线)。对于底物选择性最高的阳性变体F277L，其副产物(砜)的积累要少得多，整个反应过程中砜的含量始终小于1%。在这种情况下，积累的(S)-奥美拉唑的最大含量在24 h时增加到97%，这大大提高了手性亚砜的收率，并大大简化了从含有相似理化性质的副产物的反应混合物中纯化(S)-奥美拉唑的过程。
AcPSMO 及其变体对奥美拉唑硫醚和(S)-奥美拉唑氧化的动力学研究
进一步研究了AcPSMO和两种典型变体(F277L和L244V)对奥美拉唑硫醚和(S)-奥美拉唑的表观动力学 (表2)。以奥美拉唑硫醚为底物的催化特异性常数(kcat/Km)随突变体的不同而略有变化。突变对AcPSMO对奥美拉唑硫醚的亲和力没有显著影响，但增强了催化转换率(kcat)，因为两种突变都将大型的苯丙氨转换为较小的缬氨酸，这可能导致更好地适应奥美拉唑硫醚的进入。有趣的是，对于(S)-奥美拉唑氧化，F277的催化能力几乎被消除，与AcPSMO野生型酶相比，其催化常数(kcat/Km)仅为6.7%。相比之下，单突变体L432V表现出显著改善的kcat，并且与(S)-奥美拉唑的结合亲和力更高。结果表明，F277L的Rapp值的提高主要是由于对(S)-奥美拉唑的催化效率降低，特别是对期望产物(S)-奥美拉唑的过氧化速率减缓。
通过分子动力学模拟和 QM/MM 计算阐明底物特异性机制
CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反应的机制包括NADPH还原活性部位的FAD，还原后的E-FADH2与氧反应形成c4a-氧合黄素，黄素作为亲核试剂攻击亲电底物酮，产物和NADP+释放。据报道，Baeyer-Villiger氧化反应的NADP+释放过程是限速的，其速率常数为~ 2 s−1。当底物变成非天然的甲基苯基硫醚和拉唑亚砜时，总反应速率大大降低，限速步骤变为c4a-氧合黄素氧化硫醚的不同步骤。
为了确定AcPSMOs在两种非天然底物(硫醚和亚砜)之间的固有选择性的结构基础，测定了L432V和F277L的晶体结构。根据晶体结构，将硫醚或亚砜对接到AcPSMO WT, L432V和F277L变体中。然后，结合分子动力学(MD)模拟和QM/MM计算，阐明了WT、L432V和F277L AcPSMO变体对硫醚和亚砜氧化的机理。对于硫醚氧化，计算表明，反应是通过逐步机制进行的，其中黄素C4a-OOH的远端OH攻击硫醚，这与O-O键的异裂相结合，导致S-OH+中间体和C-O-被周围的氢键网络很好地稳定。计算得到的亚砜化势垒分别为：WT 14.9 kcal/mol、L432V 11.5 kcal/mol和F277L 11.7 kcal/mol，表明在所有这些变体中，亚砜化在动力学上都是非常有利的。
在L432V、F277L和WT的MD模拟中，亚砜的典型结合构象相似(图3)，底物的苯并咪唑环与FAD的异噁嗪环形成π -π堆叠相互作用。值得注意的是，在WT和L432V的结构中，F277和R327都能形成π-阳离子相互作用。此外，在WT和L432V中，在黄素过氧化氢(FADH-OOH)和ASP57之间都存在连接水(W1)。然而，在F277L的MD模拟过程中，水可以扩散出活性位点，导致FADH-OOH的远端H与ASP57之间发生直接的氢键相互作用。这主要是因为变体F277L可以在L277和R327之间引起明显的空间排斥力，从而将W1挤出活性位点。除277位残基外，432位残基还能影响苯并咪唑环N1-H与FADH-OOH部分之间的氢键相互作用。显然，L432V和F277L突变都可以显著改变FADH-OOH周围的氢键网络，这可能对亚砜氧化的机制和反应活性产生根本性影响。
从变体L432V (RC1)、F277L (RC2)和WT (RC3)的代表性结构出发，通过QM/MM计算进一步研究了亚砜的氧化机理。对于L432V(图4(a))，FADH-OOH的远端o原子对亚砜的亲电攻击伴随着O-O的异裂(图4(a)中的TS1a)。随后，水辅助质子(Hd)从FADH-OOH转移到Oa (ASP)，质子从N1-H转移到Op，导致质子化的ASP57和n1 -去质子化的砜产物(Int1a)。该步骤的计算势垒为16.2 kcal/mol (RC1a→TS1a)。从Int1a开始，底物中质子(Hn)向N1的转移与质子从质子化的ASP57向Op的转移相结合，导致PC1中砜产物的形成。这一步骤在热力学和动力学上都是非常有利的，只有5.6 kcal/mol的小势垒(Int1a→TS1b)。
作为比较，还研究了亚砜在F277L中的氧化机理(图4b)。与L432V相比，F277L中的亚砜氧化遵循了FADH-OOH介导的氧化机制，其中FADH-OOH的远端o原子对亚砜的亲电攻击与O-O异裂和质子(Hd)从远端Od转移到近端Op，一步生成砜产物(PC2)。该反应需要相对较高的势垒，为23.8 kcal/mol(图4b)。显然，氢键网络的变化从根本上影响了亚砜的氧化机制。QM/MM计算表明，WT中砜的形成具有20 kcal/mol的中等势垒，介于突变体F277L (23.8 kcal/mol)和突变体L432V (16.2 kcal/mol)之间。QM/ mm预测的势垒顺序与实验结果吻合较好。尤其是阐明了氢键网络在调节砜形成反应性中的重要作用。
从上述经典MD模拟和混合QM/MM计算的分析来看，D57对于FADH-OOH介导的亚砜氧化中的质子转移是必不可少的。为了进一步证实D57的催化作用，将D57替换为非极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。在F277L/D57Q突变体中，亚砜氧化为砜的活性受到很大程度的抑制，而其对奥美拉唑硫醚的活性保持不变。除实验结果外，还对突变体F277L/D57Q进行了模拟。从代表性结构出发，进行QM/MM计算，研究亚砜氧化机理。FADH-OOH的远端o原子对亚砜的亲电性攻击伴随着O-O的异裂裂解。同时，FADH-OOH向Ow (W1)的质子转移与N1-H向Op的质子转移耦合。由于与D57相比，水是一个相当弱的碱，因此发现该反应在动力学上是非常不利的。这一发现与实验结果一致，表明在F277L/D57Q突变体中，亚砜氧化成砜的过程将被很大程度上抑制。因此，D57在亚砜氧化制砜过程中起着至关重要的作用。
AcPSMO用于其它奥美拉唑硫醚不对称氧化的重新设计
在F277L/D57Q催化氧化奥美拉唑硫醚的过程中，相应的砜含量进一步降低。AcPSMO及其变体F277L和F277L/D57Q还对另外三种类似底物进行了氧化测试。突变体F277L和F277L/D57Q显著降低了所有测试底物的过氧化，尤其均显著降低了副产物砜的含量，同时所有底物的底物选择性(Rapp)均有所提高(表3)。表明基于AcPSMO的底物选择性调控机制设计的突变体成功应用于其他手性拉唑亚砜的可控合成。