今天推送的文章发表在Green Chemistry的“Engineering the substrate preference of glucose oxidase for the enzymatic oxidation of xylose”，通讯作者为山东大学微生物技术国家重点实验室的刘国栋副教授。
葡萄糖氧化酶（GOx，EC 1.1.3.4）被广泛应用于葡萄糖监测、食品和饲料添加、生物燃料电池的构建等。d-木糖是半纤维素的主要成分，是植物生物量中含量第二丰富的糖。d-木糖的有效转化是利用木质纤维素原料的关键。与GOx广泛用于检测和生物转化d-葡萄糖不同，使用氧作为电子受体有效催化d-木糖氧化为d-木糖-1,5-内酯的酶尚未报道。黑曲霉GOx（AnGOx）对d-木糖的活性比对d-葡萄糖低270倍。通常用使用过量的AnGOx氧化d-木糖，这对于工业过程来说是昂贵的。许多糖脱氢酶也具有在C1位氧化d-木糖的能力，并已用于开发d-木糖生物传感器或生产d-木糖酸盐。然而，脱氢酶对氧以外的电子受体的依赖性需要使用全细胞作为催化剂或开发电子受体-再生系统，这增加了其应用的复杂性和成本。
在本研究中，作者使用半理性设计法对AnGOx的底物特异性进行了工程设计，使其对d-木糖的活性提高了5.7倍。进行分子动力学（MD）模拟以探索突变体对d-木糖亲和力增强的潜在机制。此外，作者利用AnGOx双突变体从玉米芯水解物中同时生产木酸钠和葡萄糖酸钠。这项研究加深了对GOx底物特异性的理解，并为从木质纤维素生物质中生产木酸盐提供了一种替代方法。
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筛选对d-木糖活性增强的GOx突变体
由于通过X射线衍射测定的AnGOx的三维结构不包含底物/产物或其类似物。先前有研究使用MD模拟预测了d-葡萄糖和AnGOx活性位点口袋中氨基酸残基之间的密集相互作用。这些相互作用后来通过将AnGOx的结构叠加到与氧化产物LGC（PDB:4YNU）复合的黄曲霉葡萄糖脱氢酶（AfGDH）上而得到支持。考虑到AfGDH对d-木糖表现出相对较高的活性（约为d-葡萄糖活性的20%），作者根据其活性位点结构与AfGDH的比较对AnGOx进行工程设计。分别对底物结合口袋周围的10个残基（T110A、N217S、R176S、F215Y、Q347S、F351Y、D416H、F414L、D424E和T331N）进行定点诱变，并在酿酒酵母中表达突变体。活性测量显示，没有一个突变体对d-木糖表现出增加的活性。这些结果表明，AnGOx和AfGDH之间底物特异性差异的潜在机制可能涉及多个残基的变化。
然后，作者将重点放在活性位点中与d-葡萄糖的C6羟甲基相互作用的残基上（图1A）。根据叠加在AfGDH-LGC复合物上的结构，AnGOx的T110可以通过氢键与d-葡萄糖的C6–OH基团相互作用（图1B）。因此，选择T110使用简并NNK密码子进行饱和诱变。用d-果糖作为碳源培养表达AnGOx突变体的酿酒酵母转化体，以避免d-葡萄糖氧化的任何干扰，并收集培养上清液用于d-木糖氧化酶活性测定（图1C）。与表达野生型（WT）AnGOx的转化子相比，表达T110V和T110I突变体的转化子对d-木糖的活性显著增加。由于靶蛋白的表达水平在不同的酿酒酵母转化体之间可能不同，这可能干扰酶活性的比较。除了T110，F414与C6位置的羟基非常接近。因此，对T110V突变体的F414残基进行第二轮饱和诱变。96个转化体中有6个转化体对d-木糖的活性明显高于表达亲本突变体T110V的转化体。这6个转化子均为F414L突变，使该位置与AfGDH（L401）的位置相同。
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底物特异性改变的AnGOx突变体的特性研究
AnGOx及其突变体在酿酒酵母中的低表达水平不足以进行其表征和应用。作者改用毕赤酵进行表达并纯化。T110I、T110V和T110V/F414L对d-木糖的氧化活性分别是WT的0.6倍、1.2倍和5.7倍（表1）。相反，F414L单一突变体的d-木糖氧化酶活性与WT相似。因此，F414L突变对d-木糖氧化活性的影响取决于T110V突变。相对于WT，T110I、T110V和T110V/F414L在天然底物d-葡萄糖上的活性分别降低了96.2%、87.0%和94.4%，这表明在工程中存在选择性-活性权衡。对于T110V/F214L，d-木糖的比活性是葡萄糖的1.4倍，而对d-果糖、d-甘露糖、d-半乳糖和l-阿拉伯糖的活性几乎无法检测到（图2A）。因此，突变体对测试的单糖保持了立体选择性。
动力学参数表明（表2），WT对d-木糖的Km值是T110V的1.5倍，T110V/F414L的4.8倍，表明突变体对d-木糖具有更高的底物亲和力。然而，两个突变体的周转数（kcat）均显著下降。推测T110V和T110V/F414L对d-木糖的活性增加主要是由它们对底物的亲和力增加引起的。另外与野生型相比，两种突变体对d-葡萄糖氧化的kcat/Km降低，这归因于底物亲和力降低和周转数减少。这些结果表明，突变扩大了AnGOx的底物范围，但代价是降低了产物产率。
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分子动力学模拟
d-木糖和d-葡萄糖结构之间的唯一区别是d-木糖中缺乏外环羟甲基。为了了解d-木糖氧化酶活性提高的潜在机制，作者采用AnGOx、T110V和T110V/F414L与d-木糖的复合物进行全原子MD模拟。RMSD显示，除WT外，所有系统在100ns模拟过程中都达到了平衡状态，表明这些突变促进了d-木糖与酶的稳定结合。RMSF值的变化显示突变不影响底物结合口袋中残基的灵活性。然后，作者研究了d-木糖的O1原子与关键的两个组氨酸催化残基（H516和H559）之间的距离。与WT相比，在T110V中，d-木糖的O1更接近H516，在T110V/F414L中，其与两个组氨酸残基的距离值更低（图3A–C）。在T110V/F414L的构象中，91.6%的O1木糖–H516距离<7.0Å，86.2%的O1二甲苯–H559距离<9.0Å。这些频率明显高于WT（分别为24.7%和39.0%）。
为了详细了解d-木糖和活性位点之间的相互作用，在建模的AnGOx-LGC复合物中，选择了距离LGC 6Å距离内的10个残基（图3D），并计算了它们在模拟过程中与d-木糖的相互作用能。与H516和H559的静电和疏水相互作用在两个突变体中都得到了增强（图3E和F）。此外，与H516相邻残基，如N514和R512的静电相互作用增强。相反，与Y68的静电相互作用和与主导了d-木糖与活性位点结合的F/L414、Y68、G108和T/V110的疏水相互作用在突变体中都减少了（图3F）。MD模拟过程中产生的构象也表明了活性位点中d-木糖的不同结合模式。在WT中，d-木糖通过其吡喃糖环上的羟基与Y68和T110之间的各种相互作用以及与F414的疏水性相互作用与位于底物结合口袋开口处的位点B结合，将d-木糖拉离口袋深处的催化残基H516和H559以及的FAD（图3G）。因此，尽管底物进入通道足够宽以容纳d-木糖，但对d-葡萄糖的稳定很重要的T110和F414对于较小尺寸的底物的正确定位变得不利。由于T110和F414的相互作用在突变体中被破坏，d-木糖与位点a相互作用的机会更大，这使其C1羟基能够进入催化组氨酸残基和FAD以启动反应（图3H和I）。然而仅通过位点A处的残基稳定d-木糖增加了底物的运动自由度，并可能导致突变体的低催化效率（表2）。
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T110V/F414L共转化d-葡萄糖和d-木糖为醛糖酸
当用作水泥和混凝土添加剂时，木磺酸盐（木酸盐）表现出与葡萄糖酸盐类似的性质，具有巨大的市场潜力。此外，d-木糖酸是合成几种衍生物（如1，2，4-丁三醇和1，4-丁二醇）的中间分子，并被认为是由生物物质产生的增值平台化学物质。因此，作者测试了具有改善d-木糖氧化活性的T110V/F414L突变体从d-木糖和d-葡萄糖共生产木糖和葡萄糖酸盐的能力。反应在具有受控pH和连续曝气的生物反应器中进行。向系统中加入过氧化氢酶以消除有毒产物H2O2。LC-MS分析显示，使用纯d-木糖和d-葡萄糖的混合物作为底物，通过催化制备木酸盐和葡萄糖酸盐。
随后，将含有d-木糖和d-葡萄糖的玉米芯水解产物（木质纤维素衍生产物）用作酶促生产醛糖酸盐的底物（图5A）。与使用纯d-木糖和d-葡萄糖作为底物的反应不同，需要再次添加氧化酶和过氧化氢酶以保持连续反应，这表明水解产物中存在酶抑制化合物。反应48h后，d-木糖和d-葡萄糖的转化率分别为76.8%和100%（图5B）。结果表明，具有扩大底物范围的工程化AnGOx具有用于从木质纤维素材料中酶促生产醛糖酸的潜力。然而，由于周转数较低，突变体在高底物浓度下可能会失去其优势（表2）。