三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵襲性的一種，由于不表達激素受體以及HER2，無法使用靶向治療，長期以來TNBC患者隻能接受手術以及放化療。
免疫檢查點抑制劑療法的出現為TNBC患者帶來了新的希望，然而臨床試驗發現PD-1抑制劑聯合化療僅能使一小部分TNBC患者獲益[1,2]。是以，探究TNBC對免疫檢查點抑制劑治療耐藥的機制至關重要，這将為改善免疫治療效果提供參考。
近期，由Dana-Farber癌症中心Judith Agudo教授領銜的研究團隊在Cell期刊發表重要研究成果[3]，他們發現在TNBC中有一群抵抗T細胞殺傷的靜息惡性良性腫瘤細胞（QCCs）。這些QCCs通過激活HIF1a，與免疫抑制性成纖維細胞、功能失調的DC細胞一起形成了一個抵禦T細胞浸潤與殺傷的微環境。進而在免疫治療中存活下來并引起惡性良性腫瘤複發。
這項研究成果為我們揭開了乳腺癌免疫逃逸的神秘面紗，突出了QCCs在乳腺癌免疫逃逸中的重要作用，提示我們靶向清除QCCs可能是破解TNBC免疫耐藥難題的有效途徑。
論文首頁截圖
以往有研究發現一些基因在惡性良性腫瘤細胞抵抗免疫治療中具有一定作用[4,5]，但是這些研究并不能解釋惡性良性腫瘤細胞是如何營造出一個免疫抑制性微環境的；此外，通過測序的手段能夠找到對免疫檢查點抑制劑治療耐藥惡性良性腫瘤所具備的一些特征，但是惡性良性腫瘤組織中存在大量異質性的細胞群體，這大大增加了尋找惡性良性腫瘤耐藥機制的難度。例如丢失惡性良性腫瘤抗原的癌細胞與惡性良性腫瘤抗原陽性的癌細胞在逃脫免疫系統追殺過程中采取的方法顯然是不同的。
在這項研究中，Agudo教授團隊希望探究那些表達惡性良性腫瘤抗原的癌細胞是怎麼逃脫免疫系統的追殺的。是以，他們為小鼠接種了表達GFP或mCherry的TNBC細胞系4T07，并為小鼠轉輸特異性識别GFP的PD-1-/-Jedi T細胞(敲除PD-1是為了模拟PD-1抑制劑治療)。由于Jedi T細胞的TCR隻能特異性識别GFP而不能識别mCherry。是以該實驗模型可以用來探究持續表達惡性良性腫瘤特異性抗原的惡性良性腫瘤細胞(GFP+惡性良性腫瘤細胞)是如何逃脫惡性良性腫瘤抗原特異性T細胞(Jedi T細胞)的攻擊。
研究團隊在轉輸Jedi T細胞後第5天分析惡性良性腫瘤内GFP+與mCherry+惡性良性腫瘤細胞的比例，發現Jedi T細胞殺死了大部分GFP+惡性良性腫瘤細胞，但是仍然有一部分GFP+惡性良性腫瘤細胞逃脫了T細胞的殺傷。免疫熒光染色發現這些逃脫殺傷的GFP+惡性良性腫瘤細胞形成了一個細胞簇，在細胞簇内部T細胞浸潤水準降低了兩倍。這說明幸存的GFP+惡性良性腫瘤細胞簇能夠阻止T細胞的浸潤，這可能是導緻其對免疫治療産生抵抗的原因之一。
Jedi T細胞攻擊後存活的GFP+惡性良性腫瘤細胞聚內建簇
接下來，Agudo教授團隊分析了幸存的GFP+惡性良性腫瘤細胞與對照mCherry+惡性良性腫瘤細胞的轉錄組差異。他們發現，與mCherry+惡性良性腫瘤細胞相比，GFP+惡性良性腫瘤細胞中與細胞周期相關的基因明顯下調。EdU（胸腺嘧啶核苷類似物5-乙炔-20-脫氧尿苷）摻入實驗表明這些在Jedi T細胞攻擊後存活的GFP+惡性良性腫瘤細胞處于細胞周期停滞狀态（稱為靜息惡性良性腫瘤細胞，QCCs）。
那麼這些QCCs是否對T細胞的殺傷更具抗性呢？研究團隊向惡性良性腫瘤細胞中轉入tdTomato-p27K，這可以使QCCs被tdTomato标記。向荷瘤小鼠轉輸PD-1-/- Jedi T細胞後發現，相比于對照非免疫原性miRFP670+惡性良性腫瘤細胞，存活下來的GFP+惡性良性腫瘤細胞大部分都是tdTomato+的，這說明QCCs對T細胞的殺傷具有更強的抵抗能力。
在Jedi T細胞攻擊中存活下來的GFP+惡性良性腫瘤細胞處于細胞周期靜息狀态，并對T細胞的殺傷具有更強的抵抗力
以上的結果表明在小鼠模型中，QCCs是免疫治療耐藥的主力，那這種現象在人類患者中是否也存在呢？通過分析乳腺癌患者組織病理樣本以及轉錄組測序，研究院隊發現，在惡性良性腫瘤組織中與T細胞接觸的惡性良性腫瘤細胞大多是Ki67+的增殖細胞，p27+的QCCs極少與T細胞接觸；同時基因集富集分析表明，與治療無應答者相比，免疫治療應答患者的惡性良性腫瘤細胞在DNA複制相關通路更加富集，表明它們處于非靜止狀态。這種相關性提示我們，QCCs可能與乳腺癌患者免疫治療效果不佳有關。
乳腺癌患者惡性良性腫瘤組織中靜息惡性良性腫瘤細胞周圍T細胞浸潤較少，并且對免疫治療有應答的患者其惡性良性腫瘤細胞處于細胞周期活躍狀态
為了探究QCCs的耐藥機制，研究團隊對QCCs以及非靜止惡性良性腫瘤細胞進行RNA測序。資料分析表明，QCCs上調了缺氧以及葡萄糖代謝相關通路基因。免疫熒光染色結果顯示，p27K+QCCs與缺氧探針共定位，而T細胞則很少浸潤至缺氧區域；Jedi T細胞治療後幸存的GFP+惡性良性腫瘤細胞也位于低氧區域中。這些資料表明乳腺癌中的QCCs主要位于T細胞浸潤較少的缺氧微環境中。
QCCs所在區域處于明顯的低氧狀态，并且T細胞浸潤較少
接下來，為了在單細胞水準上分析QCCs抑制T細胞功能的機制，Agudo教授團隊分離了QCCs細胞簇内外的浸潤細胞，并對其進行單細胞轉錄組測序。
通過資料分析發現，QCCs細胞簇内部存在大量免疫抑制性成纖維細胞，這解釋了為何QCCs區域浸潤T細胞數目較少。
對QCCs細胞簇内外浸潤T細胞進行分析發現，浸潤在缺氧的QCCs細胞簇内部的CD8+ T細胞耗竭程度更深，殺傷能力更弱。
QCCs細胞簇内部存在大量免疫抑制性成纖維細胞，浸潤的T細胞數量顯著低于QCCs細胞簇外，并且QCCs細胞簇内浸潤的T細胞耗竭程度更高
究竟是哪群細胞促進了T細胞的功能失調呢？通過對QCCs内部浸潤各細胞亞群進行缺氧特征評分，研究團隊發現DC細胞表達豐富的缺氧相關基因，并且下調促進T細胞活化的基因，如MHCⅠ與MHCⅡ、IL-12、CD80/86，表明這些DC細胞促進T細胞活化的能力極大地減弱了，這可能是QCCs細胞簇内部浸潤的T細胞功能失調的重要原因。
但是Agudo教授團隊通過缺氧誘導實驗發現，缺氧并不能直接削弱DC細胞活化T細胞的能力，是以研究團隊将目光轉向QCCs本身。探究是否是表達HIF1a的QCCs塑造了免疫抑制性的微環境，損傷DC細胞活化T細胞的能力進而抑制了T細胞免疫應答。為此，他們建構了表達活化型HIF1a(HIF1aSTBL)的乳腺癌細胞系。
荷瘤實驗顯示，相比于WT惡性良性腫瘤，表達HIF1aSTBL的惡性良性腫瘤内浸潤的T細胞數量更少，耗竭程度更深；瘤内DC細胞上MHCⅡ表達明顯下調，這些現象與在QCCs細胞簇内部觀察到的基本一緻。
更進一步地，研究團隊将WT或表達HIF1aSTBL的GFP+惡性良性腫瘤細胞與mCherry+惡性良性腫瘤細胞混合接種至小鼠皮下。發現相比于mCherry+: GFP+惡性良性腫瘤組，接種了mCherry+: GFP+ HIF1aSTBL惡性良性腫瘤細胞的小鼠瘤内浸潤T細胞數量更少，并且T細胞更難接近GFP+惡性良性腫瘤細胞，存活的GFP+惡性良性腫瘤細胞的數量增加了數倍，可見HIF1a能夠促進惡性良性腫瘤細胞免疫逃逸。
惡性良性腫瘤細胞過表達HIF1aSTBL後能夠抑制T細胞的浸潤并逃脫T細胞的攻擊
綜合以上資料可見，QCCs正是通過高表達HIF1a進而來營造一個免疫抑制性的微環境，逃脫惡性良性腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的追殺。那麼敲除惡性良性腫瘤細胞中的HIF1a是否就能夠促進T細胞對惡性良性腫瘤的殺傷呢？實驗結果表明敲除惡性良性腫瘤細胞中的HIF1a後，惡性良性腫瘤内浸潤T細胞數量顯著增加并且耗竭程度降低，惡性良性腫瘤體積明顯減小。這提示我們靶向惡性良性腫瘤内HIF1a能夠促進抗惡性良性腫瘤免疫應答，抑制惡性良性腫瘤生長。
敲除惡性良性腫瘤細胞中的HIF1a顯著增強了抗惡性良性腫瘤免疫應答
總的來說，這項研究揭示了惡性良性腫瘤抗原陽性的癌細胞免疫逃逸的機制：它們聚內建團，召喚成纖維細胞為它們築起屏障；一起進入靜息狀态并高表達HIF1a，使得免疫系統的哨兵——DC細胞功能失調，進而抑制T細胞免疫應答。這些努力使得它們得以逃脫T細胞的追殺，并在免疫治療後卷土重來。
同時，這項研究結果也提示我們根除QCCs是改善TNBC免疫治療效果和預防惡性良性腫瘤複發的關鍵。
參考文獻：
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3. Baldominos P, Barbera-Mourelle A, Barreiro O, et al. Quiescent cancer cells resist T cell attack by forming an immunosuppressive niche [published online ahead of print, 2022 Apr 15]. Cell. 2022;S0092-8674(22)00343-9. doi:10.1016/j.cell.2022.03.033
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責任編輯丨應雨妍