幹細胞克隆豬取得突破

經過三次基因編輯的幹細胞克隆小豬。（資料圖/圖）

家畜幹細胞在生命科學基礎研究、細胞培養人造肉生産和優良品種培育等方面具有巨大應用前景。自1981年小鼠胚胎幹細胞獲得成功以來，科學家一直試圖建立穩定的、可長期傳代的大家畜胚胎多能幹細胞系，但始終未獲得成功。最近中國農業大學韓建永教授團隊聯合國内多家機關獲得重大突破，成功建立了目前世界家畜幹細胞傳代次數最多（傳代260次以上）、可進行連續多次基因編輯操作的豬胚胎幹細胞系，在國際上首次獲得多輪基因編輯的幹細胞克隆豬，攻克了豬胚胎上胚層多能幹細胞建系的國際難題。2021年11月30日，該研究成果線上發表在國際著名學術期刊《細胞研究》（Cell Research）上。

家畜胚胎幹細胞建系

胚胎幹細胞是從動物胚胎發育早期分離出來的一類多能幹細胞，具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。理論上，胚胎幹細胞可以分化為動物體任何細胞類型，并能發育成完整個體。人類胚胎幹細胞主要用于損傷或疾病後的再生醫學群組織置換等領域，而家畜胚胎幹細胞則可用于基因修飾動物的制備、器官移植和家畜育種等領域。

1981年，英國劍橋大學馬丁·埃文斯等人從小鼠早期胚胎中分離出第一種哺乳動物的胚胎幹細胞。除了一些在生命科學基礎研究領域的應用之外，小鼠胚胎幹細胞最引入矚目的應用是在制備基因敲除小鼠上。1989年，美國科學家奧利弗·史密斯和馬裡奧·卡佩奇分别獨立利用小鼠胚胎幹細胞成功培育出第一批基因敲除小鼠，開創了動物功能基因研究和醫學動物模型研究的新紀元。2007年，三位科學家共同獲得了諾貝爾生理學或醫學獎。不過哺乳動物的胚胎幹細胞分離和建系難度非常大，直到1998年，美國威斯康星大學麥迪遜分校的研究人員才分離獲得第二種哺乳動物的胚胎幹細胞，即人胚胎幹細胞，掀起了胚胎幹細胞治療的研究熱潮。

相對于小鼠和人類胚胎幹細胞，家畜胚胎幹細胞研究之路更加曲折。經過四十年的探索，國内外的科學家在家畜胚胎幹細胞研究領域進展仍然非常有限。培育的所謂家畜胚胎幹細胞，要麼是難以達到小鼠和人類胚胎幹細胞的标準，往往隻具有胚胎幹細胞部分特性，要麼是傳代次數偏少，而且經不起折騰，無法耐受多次轉基因、基因編輯操作，難以制備出健康存活的基因修飾動物。

穩定傳代超過二百次

豬既是重要的肉食家畜，也是重要的實驗動物，在基礎研究、人類疾病模型、異種器官移植等領域用途廣泛。針對家畜胚胎上胚層多能幹細胞建系困難，傳代次數短，難以承受多次基因編輯操作等國際難題，中國農業大學韓建永團隊聯合四川農業大學、中國科學院動物研究所、中國科學院北京基因研究所、東北農業大學等機關，以豬為模式生物，開展了聯合科技攻關，取得家畜胚胎幹細胞領域的重大突破。

研究人員從早期胚胎多能性發育調控分子機制入手，攻克了豬早期胚胎單細胞分離技術，首次繪制了豬胚胎第0-14天（完整的附植前階段）高品質單細胞轉錄組圖譜,成功解析了豬上胚層多能性狀态(初始态、中間态和激發态)變化及調控的分子機制，并發現豬胚胎外胚層的增殖和維持需要激活素A和成纖維細胞生長因子2（FGF2）的存在，這也是小鼠和人類胚胎幹細胞自我更新所必需的。

在上述研究的基礎上，研究人員推測豬胚胎發育的第8-10天是形成多能幹細胞的理想階段。他們研發出一種可顯著維持多能幹細胞狀态的培養基，創制了豬上胚層多能幹細胞培養體系，成功利用第10天的胚胎上胚層細胞建立15株胚胎幹細胞系,細胞能夠維持上胚層多能性狀态,具有典型幹細胞特征。這些胚胎幹細胞可以在不發生任何分化的情況下穩定傳代240代以上，最多傳代次數可達260代，這是目前世界上已報道傳代次數最多的大動物幹細胞系，解決了家畜胚胎幹細胞傳代次數少的難題。

研究人員對豬上胚層多能幹細胞進行了多組學聯合分析，其中通過高通量染色質構象捕獲(Hi-C)測序技術建構了豬上胚層多能幹細胞的基因組結構三維，發現豬上胚層多能幹細胞的染色質結構松散，是其具有較強細胞分化能力的重要原因。研究人員還鑒定出75個與豬上胚層多能幹細胞保持多能性等功能高度相關的轉錄因子,為後續豬多能幹細胞調控機制研究奠定了重要基礎。

為了檢測所建立的豬上胚層多能幹細胞系是否支援耐受多輪基因操作，研究人員對豬上胚層多能幹細胞系進行了三次連續的基因操作，第一次基因操作是采用基因轉染的方式将綠色熒光蛋白基因随機整合到幹細胞基因組中，第二次基因操作是采用CRISPR/Cas9将外源基因定點插入到基因組指定位置，第三次基因操作則是采用單堿基編輯器對一個影響毛色的基因進行了堿基C到T的置換。經過三輪基因操作之後，幹細胞仍然保持較好的狀态。接下來，研究人員以經過三次基因編輯的幹細胞系為供體細胞,通過核移植技術，獲得來源于豬上胚層多能幹細胞、出生存活的基因編輯克隆豬，解決了家畜胚胎幹細胞難以承受長周期、連續多次基因編輯的國際難題。

廣闊的應用前景

該研究首次建立了可穩定傳代240次以上的豬胚胎幹細胞系，并成功獲得經過多次基因編輯操作的克隆豬，在生命科學基礎研究、細胞培養肉生産、醫學動物模型、家畜幹細胞育種等領域具有廣闊的潛在用途。

在生命科學基礎研究領域，作為一種全新的、穩定的胚胎多能幹細胞系，豬上胚層多能幹細胞成功建系，開創了家畜多能幹細胞研究的新方向。與小鼠相比，豬的胚胎發育和人類更加相似,豬的胚胎幹細胞是研究人類胚胎發育更為理想的細胞模型。通過豬、人、小鼠等不同物種的多能幹細胞比較，能夠發現幹細胞多能性維持的物種間差異性和統一性，為異種器官移植等再生醫學研究提供理論依據。

在細胞培養肉領域，豬上胚層多能幹細胞可作為未來細胞培養等基于細胞的功能性産品的種子細胞。目前細胞培養肉研制的種子細胞多為肌肉和脂肪細胞的祖細胞,并不具有長期傳代增殖能力，成為體外大規模生産細胞培養肉的技術瓶頸。豬上胚層多能幹細胞能夠在體外長期穩定傳代,通過體外大規模培養,獲得大量初始細胞,再通過定向誘導分化獲得肌肉細胞和脂肪細胞，可以解決“種子細胞”傳代時間短等細胞培養肉的技術難題。

在醫學模式動物研究領域，豬上胚層多能幹細胞與基因編輯結合,可用于建構人類疾病模型或異種器官移植。目前使用豬體細胞核移植的主要限制之一是供體細胞通常隻能支援一次基因組編輯，難以同時獲得多基因編輯克隆家畜,通常需要采用重複性克隆和重新分離成纖維細胞,才能實作多輪基因編輯，周期短，效率低。實驗證明豬上胚層多能幹細胞對基因編輯有很好的耐受性，至少可以耐受三次連續的基因編輯,這将大大減少制備多基因編輯克隆豬的時間和成本。

在家畜優良品種培育領域，豬上胚層多能幹細胞通過定向誘導分化為精子和卵母細胞可以實作幹細胞育種。胚胎幹細胞可以在體外誘導完成配子發育的整個過程，形成有功能的精子或卵母細胞。将幹細胞與基因組測序和基因組選擇等技術結合，再通過體外生殖細胞誘導和體外受精，獲得子代胚胎，結合基因組選擇技術，可以在實驗室中完成優良家畜胚胎的批量生産和精準選擇，實作家畜幹細胞育種，可顯著縮短世代間隔和提高選擇強度，快速獲得30-40倍的遺傳增益，實作重要經濟性狀的快速遺傳改良。

不過，從豬胚胎幹細胞建系成功到細胞培育肉、幹細胞育種等産業化應用，還需要進一步深入研究，重點解決效率、成本等問題。

南方周末特約撰稿 湯波