大家好，今天推送的文章是2024年9月發表在 ACS Catalysis 上的“A High-Throughput Screening Platform for Engineering Poly(ethylene Terephthalate) Hydrolases”，通訊作者是來自美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室的Hau B. Nguyen。
PET 水解酶能夠水解聚對苯二甲酸乙二醇酯 (PET)，使得廢塑膠具有生物工業回收的潛力。目前許多 PET 水解酶都經過了改造，提高了催化活性和穩定性，但目前的篩選方法在篩選大型文庫（包括在高溫條件下）方面存在局限性。本文作者團隊開發了一個平台，可以通過配對的平闆分裂綠色熒光蛋白和模型底物篩選同時檢測多個 PET 水解酶突變體的蛋白質溶解性、熱穩定性和活性。作者團隊應用該平台通過定向進化提高了基準 PET 水解酶葉枝堆肥角質酶(leaf-branch compost cutinase,LCC)的性能。
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用于工程 PET 水解酶的內建平台
如圖 1 所示，作者開發了一個篩選平台，通過随機誘變進行定向進化，該平台可以同時高效評估每個進化輪次中≥104 個突變體的 PET 水解酶庫，包括蛋白質表達和溶解度、接近 70 ℃ 的熱穩定性和催化性能。平台由四個部分組成：(1) 通過 DNA 改組建立一個大型随機誘變庫，(2) HT（≥104 個突變體）菌落水準共篩選試驗，用于獲得大型文庫在 BHET 模型底物瓊脂平闆上酶變體的活性、表達和溶解度，(3）使用無定形 PET 薄膜或高結晶度 PET 粉末底物對細胞裂解物進行驗證（∼102 種突變體）篩選試驗，以鑒定從 (2) 中選擇的 PET 底物上具有更高活性的酶變體，(4) 使用純化酶和各種 PET 底物（包括無定形 PET 薄膜、無定形 PET 粉末和高結晶度 PET 粉末）表征最終的酶最優值（1 到 10 種變體）。內建到定向進化平台後，能夠從起始酶支架生成随機誘變文庫，在不同選擇壓力（例如，升高溫度和升高底物濃度）下進行篩選，選擇改進的酶變體，并驗證其改進的特性和序列（圖 1d、f），每輪進化大約需要 6-8 周。改進的酶變體被彙集起來，作為親本進行進一步的定向進化，重新開始定向進化周期。經過幾輪定向進化後，作者選擇了最終的酶最優方案，使用 HPLC 對芳香族單體産物進行定量分析，并在 pH 控制的生物反應器中測量 PET 水解情況，進行詳細的性能分析。
圖 1
平台的第一步是 HT 共篩選試驗，該試驗在菌落水準上評估大量酶變體文庫在模型底物瓊脂平闆上的活性和溶解度。圖 2 詳細說明了 HT 共篩選試驗的工作原理，它涉及兩個同時進行的步驟：(1) 通過分裂 GFP 互補評估酶溶解度和濃度；(2) 通過與 BHET 作為模型底物的反應評估活性。
圖 2
作者團隊評估了從上述 HT 聯合篩選試驗中選出的改進酶變體 (∼101-102) 在無定形 PET 薄膜試樣或高結晶度 PET 粉末上的催化性能（圖 1c）。然後将鑒定出的改良酶變體用作下一輪定向進化的親本，或者如果确定已達到預期的工程目标，則使用 HPLC 和 pH 控制的生物反應器進行表達、純化和更徹底的表征。
建構平台完成後作者使用 HT 篩選平台進行葉枝堆肥角質酶(leaf-branch compost cutinase,LCC)工程，目的是為了證明新開發的平台能夠提高基準 PET 水解酶 LCC-ICCG (最有效的 PET 水解酶之一)的催化效率。首先使用野生型 LCC (LCC-WT) 作為起始模闆，啟動定向進化。使用 DNA 改組建立含有随機突變的 DNA 片段文庫，将其克隆到帶有 C 端 GFP11 标簽的 pET21b(+)-GFP11 篩選載體中，并轉化到大腸杆菌中。然後使用 HT 共篩選試驗篩選酶文庫，首先進行粗篩選，然後進行細篩選。第一輪篩選出的酶變體大多含有單個突變，包括 P38L、V118I 和 L159Q，與 LCC-WT 相比，它們在 BHET 瓊脂平闆上表現出更高的活性（更大的透明區）,然後将這些變體彙集在一起作為親本進行第二輪定向進化。經過兩輪定向進化，獲得了變體 LCC-F2，其突變位點為 V118I、A149V、L159E 和 V202I，與 LCC-WT 相比，其活性更高，并且在 BHET 瓊脂平闆上的酶溶解度/濃度相當。驗證試驗使用歸一化至最終濃度為 0.1 μM 的細胞裂解物中的酶進行，結果表明，與 LCC-WT 相比，反應 6 小時後 LCC-F2 對高結晶度 PET 粉末的活性高出約 13%。然而與 LCC-ICCG 相比，該變體在相同底物上的活性低約 23%，是以作者繼續進行多輪定向進化。
之前的報道表明，在 LCC-WT (D238C− S283C) 中添加二硫鍵可提高酶的熱穩定性。作者團隊為了提高 LCC-F2 的性能，将二硫鍵添加到 LCCF2 和 LCC-P38L 變體中來建構相同的二硫鍵，并将 LCC-ICCG 作為下一輪定向進化中改組的起始支架之一。在第三輪進化後，選擇一個變體LCC-F6，它除了LCC-ICCG突變（Y127G、D238C、F243I 和S283C）外，還包含突變P38L、L117P 和A149V，因為它在70 ℃ 下反應6 小時後，在無定形PET 薄膜試樣和高結晶度PET 粉末基材上均表現出與LCC-ICCG相當的活性。與LCC-ICCG相比，該變體也具有相似的表達和溶解度水準。作者的目标是設計新的 LCC 變體，使其在無定形 PET 試樣（實驗室規模的 PET 水解酶測試中普遍存在）上的水解性能優于基準 LCC-ICCG。使用 LCC-F6 作為模闆，進行第四輪定向進化，産生了兩個最佳變體：LCC-B8 和 LCC-C9。除了 LCC-ICCG 親本中存在的突變（Y127G、D238C、F243I 和 S283C）外，LCC-B8 還含有突變 P38L、L117P、A149V 和 S247L，LCC-C9 含有突變 P38L、Y61C、M91I、L117P、A149V 和 S247L。在 70 ℃ 下與無定形 PET 薄膜試樣反應 6 小時後，與 LCC-ICCG 相比，LCC-B8 的芳香族産物釋放量高 5.2 倍，最大速率高 5.6 倍，而 LCC-C9 的芳香族産物釋放量高約 11 倍，最大速率高 10.6 倍。但這兩個變體顯示出較低的對高結晶度 PET 粉末的活性，與 LCC-ICCG 相比，芳香族産物分别減少了約 16% 和 22%。将這兩個變體 LCC-B8 和 LCC-C9 彙集在一起，再進行一輪定向進化，第五輪定向進化産生了最佳變體 LCC-LANL，與 LCC-ICCG 相比，在 70°C 下與無定形 PET 薄膜試樣反應 6 小時後，芳香族産物釋放量高出 14.3 倍，最大速率高出 13.9 倍。是以從 1 L 細胞培養物中表達和純化後，選擇該變體 LCC-LANL 進行最終表征，LCC-LANL 含有九個突變：P38L、Y61C、M91I、L117P、A149V、H218Y、Q224H、S247L 和 T256I，此外還有 LCC-ICCG 支架中存在的突變（Y127G、D238C、F243I 和 S283C）。
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LCC-LANL 的特性和結構分析
作者将純化酶 LCC-LANL 的性能與 LCC-ICCG 進行了比較，發現在 68 ℃ 下水解無定形 PET 薄膜試樣時，LCC-LANL 的最大催化速率比母體酶 LCC-ICCG 更高（圖 3）。分析采用紫外吸光度和 HPLC 芳香族單體定量法（圖 3a），兩種方法得到的結果相似（圖 3b-e）。雖然初始反應是在據報道 LCC-ICCG 具有最高活性的條件下進行的，但作者選擇在不同溫度和更長反應時間下進一步評估 LCC-LANL和 LCC-ICCG。是以在 65 ℃ 和 70 ℃下對 LCC-LANL 和 LCC-ICCG 進行了額外測試。與 68 ℃ 下的結果類似，觀察到 LCC-LANL 在 65 ℃ 下表現出比 LCC-ICCG 更高的最大速率，紫外吸光度測量和 HPLC 單體定量之間的結果相似。然而在 70 ℃ 時，與 LCC-ICCG 相比，LCC-LANL 的最大水解速率沒有顯著增加，并且在孵育 8 小時後活性開始降低。然而使用純化蛋白質時，LCC-LANL 與 LCCICCG 的産品釋放和最大速率的增加并不像使用具有相同酶濃度的粗細胞裂解物那樣大。
圖 3
盡管與 LCC-ICCG 相比，LCC-LANL 的最大速率顯著增加，但它的活性似乎在 12 小時後趨于穩定。原因有可能是熱穩定性降低或産品抑制。在篩選 LCC-LANL 變體時，實施 80 ℃ 1 小時的熱處理作為選擇壓力，以保持 LCC-ICCG 的高熱穩定性，并且證明 LCC-ICCG 不會經曆産物抑制。但為了充分确定 LCC-LANL 熱穩定性降低的程度和潛在影響，作者進行了進一步的實驗，差示掃描量熱法分析表明，每種酶的熱展開本質上是一個不可逆過程，LCC-LANL 和 LCC-ICCG 從天然狀态展開到變性狀态時表現出可比的能量障礙 (Eact)。然而 LCC-LANL 可以在比 LCC-ICCG 低約 10 °C 的溫度 (Tact) 下以給定的頻率克服這個能量障礙，是以其動力學穩定性低于後者變體。盡管具有此特性，使用分裂 GFP 互補分析評估 LCC-LANL 的熱穩定性（圖 2e），觀察到雖然 LCC-LANL 酶在 72°C 以上存活率降低，但在較低溫度下，LCC-LANL 表現出與 LCC-ICCG 相似的熱穩定性，兩種蛋白質在 72 ℃ 熱處理後基本上保留了 100％ 的蛋白質。之後作者評估了 LCC-LANL 對這些酶在工業應用中可能遇到的各種 PET 底物的性能。
LCCLANL 的結構是使用 Rosetta 大分子模組化套件模組化的。定向進化獲得的大多數突變都導緻溶劑暴露疏水性增加。S247L 突變尤其顯示出增加了酶活性位點附近的疏水表面積（圖 5a、b）。雖然這可能會破壞蛋白質結構的穩定性，但在存在主要為疏水性的底物的情況下，這可能是有利的。此外，鑒于 H218 和 K194 的緊密堆積，這種突變消除了它們之間強大的電荷-電荷排斥互相作用。與運作 Rosetta Relax 能量最小化程式後獲得的原始解析結構 (PDB: 8JMP) 相比，發現 K194 和 H218 之間的距離增加了 0.4 Å。LCC-LANL 中 K194 的預測配置也可能允許更好的溶解，這可能适用于賴氨酸，賴氨酸是最親水的殘基之一，不參與離子對互相作用。使用 Rosetta Relax 進行結構細化的其他結果表明，其餘突變距離活性位點較遠。其中，M91I 和 T256I 突變可能在建立更均勻的疏水核心方面具有協同作用，盡管會産生幾個空隙。與 68 和 70 ℃ 相比，這些可能導緻在較低溫度（65 ℃）下 LCC-LANL 酶的移動性增加，進而提高催化效率。然而空隙也可能降低熱穩定性。L117P 突變被預測為不穩定的，因為它直接去除了主鍊氫鍵并通過在主鍊上的杠杆臂效應在蛋白質核心中産生空腔。這些可能是在 LCC-LANL 模闆上的持續進化周期中進化的有價值的目标位點。
圖 5
随後作者對 PET 與 LCC-ICCG 和 LCCLANL 進行分子對接，靈活的配體對接模拟揭示了 LCC-ICCG 活性位點附近 PET 底物的幾種穩定的非生産性結合模式。在預測的 100 種最佳結合模式中，有 60 種是生産性的，底物原子與催化殘基 S165、D210 和 H242 的距離在 4 Å 以内。值得注意的是，所有 100 種預測的最佳結合模式對于 LCC-LANL 都是有效的。對這些模式和整個集合的 Rosetta 分數及其組成項進行了統計分析。分析顯示，LCC-LANL 的對接狀态和遊離狀态之間的總 Rosetta 分數 (total_score) 差異高于 LCC-ICCG。這表明 LCC-LANL 與 PET 的結合比 LCC-ICCG 更穩定。與 PET 結合後的穩定性更高可能表現為更高的結合親和力，這可能解釋了在使用無定形 PET 膜試樣的生物反應器實驗中觀察到的更高催化效率。這也可能解釋了細胞裂解物中 LCC-LANL 與 LCC-ICCG 的最大速率與純化蛋白樣品相比存在差異，這是因為細胞裂解物中存在更多非特異性結合，這可能導緻 LCC-LANL 與 PET 薄膜試樣的結合頻率高于 LCC-ICCG。然而，在無定形 PET 粉末中沒有觀察到同樣的趨勢，這可能是因為表面結構和電荷在研磨時發生變化，并且結晶度增加。對 LCC-LANL 與這種底物類型互相作用的更詳細研究可能會對說明 LCC-LANL 在無定形薄膜上而非粉末上為何具有更高的水解活性提供有價值的見解。
文章連結：
https://doi.org/10.1021/acscatal.4c04321