今天推送的文章是2024年8月發表在Angewandte chemie International Edition上的“Ene-Reductase-Catalyzed Aromatization of Simple Cyclohexanones to Phenols”，通訊作者是南京工業大學的郭凱教授和胡玉靜副教授。
環己酮直接芳構化合成取代苯酚是現代合成化學中的一個重大挑戰。本研究作者描述了一種新的烯還原酶（TsER）催化系統，将取代的環己酮轉化為相應的苯酚。該過程涉及環己酮六元環内兩個飽和碳-碳鍵的連續脫氫，并利用分子氧來驅動反應循環。作者報道了一種ERED催化的無任何輔因子要求的縮合芳構化反應，其中ERED進行兩個連續的α，β脫氫步驟，然後是二烯酮互變異構化，以從環己酮合成苯酚（方案1）。本文所展示的方案顯示了一個通用的和有效的方法來合成取代苯酚，為現有的化學方法提供了一個有價值的補充，同時天然ERED作為催化劑取代了對昂貴的過渡金屬催化劑和有毒碘試劑的需要。
受黃素依賴性脫氫酶催化的脫氫反應的最新發展的啟發，作者設想了其他黃素酶作為執行脫氫步驟的催化劑的潛力。首先嘗試了多種黃素依賴性酶，以4-甲基環己酮作為模型底物，在沒有輔酶NAD(P)H的情況下進行反應。發現隻有少數EREDs能夠有效地催化生成新的産物。特别是來自嗜熱菌Thermus scotoductus SA-01的熱穩定性ERED（TsER）能夠在環境溫度下高效催化4-甲基環己酮轉化為目标酚類化合物，且幾乎不産生副産物。
通過優化反應條件，作者發現反應緩沖液的pH值對反應結果有重要影響。在pH 10的條件下，反應效率最高，而在中性或更低pH值以及pH 10.5以上時，反應效率顯著下降。此外，酶的用量、反應時間、共溶劑二甲基亞砜（DMSO）的濃度以及反應環境也對反應結果有顯著影響。例如，在氮氣環境下或添加NADPH時，反應産率顯著下降，這強調了氧化酶催化和氧氣在反應中的關鍵作用。有趣的是，添加FMN-Na後，反應産率顯著提高，這可能歸因于增加了氧化态FMN的存在，進而提高了反應效率。
随後，用各種環己酮研究了酶催化芳構化的範圍（圖2）。γ位烷基取代的環己酮有效地轉化為相應的産物1b-5 b，獲得了較高的産率。此外，苯基和甲氧基取代基也适用于該方法（6 b-7 b），盡管6 b的産率由于空間位阻的影響有所降低。對于帶有電子吸引基團（EWGs）的環己酮底物（8b-11b），通過将反應緩沖液的pH值調整至10，可以提高反應效率，尤其是對兩個帶有EWGs的對位取代底物（8b和10b）。α位帶有烷基取代基的底物能夠被有效轉化為相應的産物13b-17b，随着取代基體積的增大，産率逐漸降低。有趣的是，苯基取代基（産物18b）可能通過共轭效應減輕了空間阻礙的影響，産率與甲基取代基（産物13b）相當。然而，α位的弱電子吸引基團（20b）完全抑制了反應。對于帶有β位取代基的底物（21b-23b），産率低于γ位或α位取代的底物，表明β位取代存在更大的空間阻礙。此外，α和β位同時取代的環己酮（産物19b、22b）的産率低于單取代底物。該過程還與一系列四氫萘酮（産物24b、26b-28b）表現出良好的相容性。用吡啶基團替代四氫萘酮中的苯環（産物25b）也可以獲得中等産率。總體而言，随着底物取代基體積的增加，催化效率呈現明顯下降趨勢，這與EREDs的天然反應類似，尤其在3取代環己酮中表現最為明顯，限制了該酶在實際應用中的适用性。
由于不能鑒定出提供高産率的3-取代的環己酮的野生型酶，是以選擇從TsER出發開發改進的催化劑，選擇被認為與底物或黃素輔因子互相作用的活性位點口袋的氨基酸殘基（圖3b）突變為丙氨酸和苯丙氨酸用于初始測試（圖3a和3c）。除了兩個組氨酸殘基（H172和H175）沒有突變之外，選擇了在底物的5 μ m内的另外四個氨基酸殘基（C25、Y27、I67、Y177）進行誘變。最終獲得了C25D和I67T組合的雙突變體産生了更高的苯酚21 b生産率。這種增強可能歸因于活性部位體積略微增大。在鑒定最佳突變體之後，使用突變體TsER C25 D/I67 T作為催化劑測試了一系列3-取代的底物，實作了産率的顯著提高（圖3e）。為了評估酶促芳構化過程的合成效用，在pH 9.0下以mmol規模合成21 b。使用TsER C25 D/I67 T作為生物催化劑以100 mL規模進行反應。結果顯示化合物21 a的轉化率高于99%，進一步純化後獲得的總收率為70%。
作者進一步通過對模型底物1a和21 a的研究進一步闡明整體反應機制和突變體誘導的效應。結果（圖3c）表明，環己烯酮可能作為轉化中的反應中間體。當使用野生型TsER作為催化劑時，以21 c2作為底物的反應産率高于99%，而使用21 c1作為底物的反應産率為35%，與以21 a作為底物獲得的34%産率相當。是以作者假設野生型TsER催化反應的主要中間體可能是21 c1。相反，當使用TsER突變體C25 D/I67 T時，以21 c1為底物的反應獲得85%的産率，以21 c2為底物的反應獲得71%的産率。于是作者初步推測TsER C25 D/I67 T催化反應的主要中間體可能主要是21 c2。分子動力學模拟實驗也支援這一假設。
采用氣相色譜法對環己酮1a的轉化過程進行了跟蹤，并對酶促芳構化反應的機理進行了進一步分析。通過降低反應效率來更好地觀察反應過程中的變化，最初在不加入FMN-Na的情況下進行了動力學實驗。結果表明，在反應的最初10小時内，烯酮1c和苯酚1b的量逐漸增加。随着反應時間的延長，烯酮1c的量開始穩定地減少，直到其完全消失。随後加入FMN-Na的動力學實驗表明，烯酮1c的濃度在反應1小時後達到峰值，然後繼續向下波動，而苯酚1b穩定地積累。這些結果表明，烯酮1c可能在反應中作為中間體（圖4ab）。這些結果不僅進一步證明了先前關于不同TsER突變體的中間體偏好性的推測，而且證明了在反應期間烯酮中間體的形成。
根據以上結果，作者提出了TsER催化的機理（方案3）。在172和175處的兩個組氨酸殘基與底物的羰基形成氫鍵，進而穩定和活化底物。随後，在堿性環境（pH = 9-10）中，去質子化的Y177的酚羟基充當一般堿（H/D交換實驗證明了這一點），從底物的酸性α碳中奪取氫。同時，來自底物的β碳的朝向FMN N5原子取向的氫被轉移到FMN的N5原子。底物1a與TsER混合後的顯著光譜變化證明了該過程，并通過QM/MM計算進一步驗證。在此之後，中間産物從酶的空腔中釋放，并且所得的還原FMN被再氧化成其氧化形式，通過分子氧産生過氧化氫。氮氣氣氛下較低的轉化效率（表1）和反應的過氧化物檢測試劑盒的陽性檢測結果支援這一假設。然後，中間産物可能重新進入酶的空腔，進一步被兩個組氨酸殘基穩定和激活，重複上述過程。随後，産物從空腔中釋放出來，并最終經曆異構化以産生酚。
總之，該研究發現了一種在不存在NAD（P）H的情況下能夠有效催化環己酮分子芳構化的烯還原酶（TsER）。使用野生型和工程化突變體，合成了一系列的鄰位，間位和對位取代的酚類化合物。此外，該方法可以容易地放大到mmol規模的生産。為合成有價值的芳香族化合物提供了一種高效、清潔和溫和的方法。