大家好，今天推送的文章是2024年9月发表在 ACS Catalysis 上的“A High-Throughput Screening Platform for Engineering Poly(ethylene Terephthalate) Hydrolases”，通讯作者是来自美国洛斯阿拉莫斯国家实验室的Hau B. Nguyen。
PET 水解酶能够水解聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET)，使得废塑料具有生物工业回收的潜力。目前许多 PET 水解酶都经过了改造，提高了催化活性和稳定性，但目前的筛选方法在筛选大型文库（包括在高温条件下）方面存在局限性。本文作者团队开发了一个平台，可以通过配对的平板分裂绿色荧光蛋白和模型底物筛选同时检测多个 PET 水解酶突变体的蛋白质溶解性、热稳定性和活性。作者团队应用该平台通过定向进化提高了基准 PET 水解酶叶枝堆肥角质酶(leaf-branch compost cutinase,LCC)的性能。
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用于工程 PET 水解酶的集成平台
如图 1 所示，作者开发了一个筛选平台，通过随机诱变进行定向进化，该平台可以同时高效评估每个进化轮次中≥104 个突变体的 PET 水解酶库，包括蛋白质表达和溶解度、接近 70 ℃ 的热稳定性和催化性能。平台由四个部分组成：(1) 通过 DNA 改组创建一个大型随机诱变库，(2) HT（≥104 个突变体）菌落水平共筛选试验，用于获得大型文库在 BHET 模型底物琼脂平板上酶变体的活性、表达和溶解度，(3）使用无定形 PET 薄膜或高结晶度 PET 粉末底物对细胞裂解物进行验证（∼102 种突变体）筛选试验，以鉴定从 (2) 中选择的 PET 底物上具有更高活性的酶变体，(4) 使用纯化酶和各种 PET 底物（包括无定形 PET 薄膜、无定形 PET 粉末和高结晶度 PET 粉末）表征最终的酶最优值（1 到 10 种变体）。集成到定向进化平台后，能够从起始酶支架生成随机诱变文库，在不同选择压力（例如，升高温度和升高底物浓度）下进行筛选，选择改进的酶变体，并验证其改进的特性和序列（图 1d、f），每轮进化大约需要 6-8 周。改进的酶变体被汇集起来，作为亲本进行进一步的定向进化，重新开始定向进化周期。经过几轮定向进化后，作者选择了最终的酶最优方案，使用 HPLC 对芳香族单体产物进行定量分析，并在 pH 控制的生物反应器中测量 PET 水解情况，进行详细的性能分析。
图 1
平台的第一步是 HT 共筛选试验，该试验在菌落水平上评估大量酶变体文库在模型底物琼脂平板上的活性和溶解度。图 2 详细说明了 HT 共筛选试验的工作原理，它涉及两个同时进行的步骤：(1) 通过分裂 GFP 互补评估酶溶解度和浓度；(2) 通过与 BHET 作为模型底物的反应评估活性。
图 2
作者团队评估了从上述 HT 联合筛选试验中选出的改进酶变体 (∼101-102) 在无定形 PET 薄膜试样或高结晶度 PET 粉末上的催化性能（图 1c）。然后将鉴定出的改良酶变体用作下一轮定向进化的亲本，或者如果确定已达到预期的工程目标，则使用 HPLC 和 pH 控制的生物反应器进行表达、纯化和更彻底的表征。
构建平台完成后作者使用 HT 筛选平台进行叶枝堆肥角质酶(leaf-branch compost cutinase,LCC)工程，目的是为了证明新开发的平台能够提高基准 PET 水解酶 LCC-ICCG (最有效的 PET 水解酶之一)的催化效率。首先使用野生型 LCC (LCC-WT) 作为起始模板，启动定向进化。使用 DNA 改组创建含有随机突变的 DNA 片段文库，将其克隆到带有 C 端 GFP11 标签的 pET21b(+)-GFP11 筛选载体中，并转化到大肠杆菌中。然后使用 HT 共筛选试验筛选酶文库，首先进行粗筛选，然后进行细筛选。第一轮筛选出的酶变体大多含有单个突变，包括 P38L、V118I 和 L159Q，与 LCC-WT 相比，它们在 BHET 琼脂平板上表现出更高的活性（更大的透明区）,然后将这些变体汇集在一起作为亲本进行第二轮定向进化。经过两轮定向进化，获得了变体 LCC-F2，其突变位点为 V118I、A149V、L159E 和 V202I，与 LCC-WT 相比，其活性更高，并且在 BHET 琼脂平板上的酶溶解度/浓度相当。验证试验使用归一化至最终浓度为 0.1 μM 的细胞裂解物中的酶进行，结果表明，与 LCC-WT 相比，反应 6 小时后 LCC-F2 对高结晶度 PET 粉末的活性高出约 13%。然而与 LCC-ICCG 相比，该变体在相同底物上的活性低约 23%，因此作者继续进行多轮定向进化。
之前的报道表明，在 LCC-WT (D238C− S283C) 中添加二硫键可提高酶的热稳定性。作者团队为了提高 LCC-F2 的性能，将二硫键添加到 LCCF2 和 LCC-P38L 变体中来构建相同的二硫键，并将 LCC-ICCG 作为下一轮定向进化中改组的起始支架之一。在第三轮进化后，选择一个变体LCC-F6，它除了LCC-ICCG突变（Y127G、D238C、F243I 和S283C）外，还包含突变P38L、L117P 和A149V，因为它在70 ℃ 下反应6 小时后，在无定形PET 薄膜试样和高结晶度PET 粉末基材上均表现出与LCC-ICCG相当的活性。与LCC-ICCG相比，该变体也具有相似的表达和溶解度水平。作者的目标是设计新的 LCC 变体，使其在无定形 PET 试样（实验室规模的 PET 水解酶测试中普遍存在）上的水解性能优于基准 LCC-ICCG。使用 LCC-F6 作为模板，进行第四轮定向进化，产生了两个最佳变体：LCC-B8 和 LCC-C9。除了 LCC-ICCG 亲本中存在的突变（Y127G、D238C、F243I 和 S283C）外，LCC-B8 还含有突变 P38L、L117P、A149V 和 S247L，LCC-C9 含有突变 P38L、Y61C、M91I、L117P、A149V 和 S247L。在 70 ℃ 下与无定形 PET 薄膜试样反应 6 小时后，与 LCC-ICCG 相比，LCC-B8 的芳香族产物释放量高 5.2 倍，最大速率高 5.6 倍，而 LCC-C9 的芳香族产物释放量高约 11 倍，最大速率高 10.6 倍。但这两个变体显示出较低的对高结晶度 PET 粉末的活性，与 LCC-ICCG 相比，芳香族产物分别减少了约 16% 和 22%。将这两个变体 LCC-B8 和 LCC-C9 汇集在一起，再进行一轮定向进化，第五轮定向进化产生了最佳变体 LCC-LANL，与 LCC-ICCG 相比，在 70°C 下与无定形 PET 薄膜试样反应 6 小时后，芳香族产物释放量高出 14.3 倍，最大速率高出 13.9 倍。因此从 1 L 细胞培养物中表达和纯化后，选择该变体 LCC-LANL 进行最终表征，LCC-LANL 含有九个突变：P38L、Y61C、M91I、L117P、A149V、H218Y、Q224H、S247L 和 T256I，此外还有 LCC-ICCG 支架中存在的突变（Y127G、D238C、F243I 和 S283C）。
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LCC-LANL 的特性和结构分析
作者将纯化酶 LCC-LANL 的性能与 LCC-ICCG 进行了比较，发现在 68 ℃ 下水解无定形 PET 薄膜试样时，LCC-LANL 的最大催化速率比母体酶 LCC-ICCG 更高（图 3）。分析采用紫外吸光度和 HPLC 芳香族单体定量法（图 3a），两种方法得到的结果相似（图 3b-e）。虽然初始反应是在据报道 LCC-ICCG 具有最高活性的条件下进行的，但作者选择在不同温度和更长反应时间下进一步评估 LCC-LANL和 LCC-ICCG。因此在 65 ℃ 和 70 ℃下对 LCC-LANL 和 LCC-ICCG 进行了额外测试。与 68 ℃ 下的结果类似，观察到 LCC-LANL 在 65 ℃ 下表现出比 LCC-ICCG 更高的最大速率，紫外吸光度测量和 HPLC 单体定量之间的结果相似。然而在 70 ℃ 时，与 LCC-ICCG 相比，LCC-LANL 的最大水解速率没有显著增加，并且在孵育 8 小时后活性开始降低。然而使用纯化蛋白质时，LCC-LANL 与 LCCICCG 的产品释放和最大速率的增加并不像使用具有相同酶浓度的粗细胞裂解物那样大。
图 3
尽管与 LCC-ICCG 相比，LCC-LANL 的最大速率显著增加，但它的活性似乎在 12 小时后趋于稳定。原因有可能是热稳定性降低或产品抑制。在筛选 LCC-LANL 变体时，实施 80 ℃ 1 小时的热处理作为选择压力，以保持 LCC-ICCG 的高热稳定性，并且证明 LCC-ICCG 不会经历产物抑制。但为了充分确定 LCC-LANL 热稳定性降低的程度和潜在影响，作者进行了进一步的实验，差示扫描量热法分析表明，每种酶的热展开本质上是一个不可逆过程，LCC-LANL 和 LCC-ICCG 从天然状态展开到变性状态时表现出可比的能量障碍 (Eact)。然而 LCC-LANL 可以在比 LCC-ICCG 低约 10 °C 的温度 (Tact) 下以给定的频率克服这个能量障碍，因此其动力学稳定性低于后者变体。尽管具有此特性，使用分裂 GFP 互补分析评估 LCC-LANL 的热稳定性（图 2e），观察到虽然 LCC-LANL 酶在 72°C 以上存活率降低，但在较低温度下，LCC-LANL 表现出与 LCC-ICCG 相似的热稳定性，两种蛋白质在 72 ℃ 热处理后基本上保留了 100％ 的蛋白质。之后作者评估了 LCC-LANL 对这些酶在工业应用中可能遇到的各种 PET 底物的性能。
LCCLANL 的结构是使用 Rosetta 大分子建模套件建模的。定向进化获得的大多数突变都导致溶剂暴露疏水性增加。S247L 突变尤其显示出增加了酶活性位点附近的疏水表面积（图 5a、b）。虽然这可能会破坏蛋白质结构的稳定性，但在存在主要为疏水性的底物的情况下，这可能是有利的。此外，鉴于 H218 和 K194 的紧密堆积，这种突变消除了它们之间强大的电荷-电荷排斥相互作用。与运行 Rosetta Relax 能量最小化程序后获得的原始解析结构 (PDB: 8JMP) 相比，发现 K194 和 H218 之间的距离增加了 0.4 Å。LCC-LANL 中 K194 的预测配置也可能允许更好的溶解，这可能适用于赖氨酸，赖氨酸是最亲水的残基之一，不参与离子对相互作用。使用 Rosetta Relax 进行结构细化的其他结果表明，其余突变距离活性位点较远。其中，M91I 和 T256I 突变可能在建立更均匀的疏水核心方面具有协同作用，尽管会产生几个空隙。与 68 和 70 ℃ 相比，这些可能导致在较低温度（65 ℃）下 LCC-LANL 酶的移动性增加，从而提高催化效率。然而空隙也可能降低热稳定性。L117P 突变被预测为不稳定的，因为它直接去除了主链氢键并通过在主链上的杠杆臂效应在蛋白质核心中产生空腔。这些可能是在 LCC-LANL 模板上的持续进化周期中进化的有价值的目标位点。
图 5
随后作者对 PET 与 LCC-ICCG 和 LCCLANL 进行分子对接，灵活的配体对接模拟揭示了 LCC-ICCG 活性位点附近 PET 底物的几种稳定的非生产性结合模式。在预测的 100 种最佳结合模式中，有 60 种是生产性的，底物原子与催化残基 S165、D210 和 H242 的距离在 4 Å 以内。值得注意的是，所有 100 种预测的最佳结合模式对于 LCC-LANL 都是有效的。对这些模式和整个集合的 Rosetta 分数及其组成项进行了统计分析。分析显示，LCC-LANL 的对接状态和游离状态之间的总 Rosetta 分数 (total_score) 差异高于 LCC-ICCG。这表明 LCC-LANL 与 PET 的结合比 LCC-ICCG 更稳定。与 PET 结合后的稳定性更高可能表现为更高的结合亲和力，这可能解释了在使用无定形 PET 膜试样的生物反应器实验中观察到的更高催化效率。这也可能解释了细胞裂解物中 LCC-LANL 与 LCC-ICCG 的最大速率与纯化蛋白样品相比存在差异，这是因为细胞裂解物中存在更多非特异性结合，这可能导致 LCC-LANL 与 PET 薄膜试样的结合频率高于 LCC-ICCG。然而，在无定形 PET 粉末中没有观察到同样的趋势，这可能是因为表面结构和电荷在研磨时发生变化，并且结晶度增加。对 LCC-LANL 与这种底物类型相互作用的更详细研究可能会对说明 LCC-LANL 在无定形薄膜上而非粉末上为何具有更高的水解活性提供有价值的见解。
文章链接：
https://doi.org/10.1021/acscatal.4c04321