在過去的十年裡，免疫療法的出現改變了癌症治療的模式。許多靶向程式性細胞死亡蛋白-1（PD-1）或其配體（PD-L1）的治療藥物已被監管機構準許作為單一治療藥物，或與化療和其他靶向藥物聯合使用。在臨床研究中，PD-L1免疫組織化學（IHC）和惡性良性腫瘤突變負荷（TMB）是迄今為止發現的主要預測性生物标記物，然而，PD-L1 IHC仍然是臨床實踐中用于告知免疫檢查點抑制劑（ICI）治療的主要輔助診斷試驗。
PD-L1在惡性良性腫瘤細胞和惡性良性腫瘤浸潤性免疫細胞表面表達，多種惡性良性腫瘤類型的研究已經确定了PD-L1水準與單藥抗PD-1/PD-L1治療的臨床益處之間的關聯。雖然PD-L1高表達的患者通常能獲得最大的臨床益處，但惡性良性腫瘤低或無PD-L1表達的患者也依然能受益，這促使我們需要進一步探索不斷進化的癌症基因組變化與浸潤性免疫細胞亞型之間的因果關系。
考慮到PD-L1作為單一生物标記物的局限性，我們需要了解複雜的惡性良性腫瘤微環境（TME），以開發更好的生物标記物和診斷方法，更準确地預測臨床效益，至關重要的是，更有針對性地對惡性良性腫瘤産生有效的免疫反應。
預測性生物标志物
PD-L1 IHC
與突變的二進制性不同，PD-L1是一種線性生物标記物，是以可以在多個表達門檻值下進行評估。由于惡性良性腫瘤細胞和免疫細胞上PD-L1表達的複雜生物學特性，已準許的PD-L1 IHC分析不僅采用不同的表達門檻值，而且采用不同的評分方法。PD-L1評分算法具有分析特異性、适應症、依賴性，并且根據治療路線而變化。有些檢測僅對惡性良性腫瘤細胞表達進行評分（忽略免疫細胞），而有些檢測僅對免疫細胞的PD-L1進行評估（忽略惡性良性腫瘤細胞），其它檢測則對惡性良性腫瘤和免疫細胞的PD-L1同時進行測量。下表顯示了非小細胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD-L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，這些經驗證的截止值的準許和用途是特定于國家的。
PD-L1的表達是動态的，在惡性良性腫瘤類型、惡性良性腫瘤部位，甚至在同一惡性良性腫瘤标本中表現出顯著差異。惡性良性腫瘤細胞中PD-L1的表達受基因組、表觀遺傳學和轉錄機制的調控。惡性良性腫瘤細胞上的PD-L1與NSCLC中CD8+T細胞浸潤程度之間的強相關性很可能是由于對發炎信号（如IFN-γ）反應中的轉錄調節，這些發炎信号是由活躍的抗惡性良性腫瘤免疫反應産生的。
PD-L1的非均勻表達（通常局限于免疫浸潤區域）表明，由于TME内相關細胞因子的高局部濃度，PD-L1被适應性誘導，并進一步突出了惡性良性腫瘤内的異質性。PD-L1的惡性良性腫瘤内異質性和可塑性可能會影響患者的管理決策，此外，由于采樣可能會産生假陰性得PD-L1 IHC結果。活檢的位置和已進行過的治療是PD-L1表達的重要參數。由于臨床原因，在治療開始時獲得新的活檢可能不可行，但由于免疫反應的可塑性，尤其是PD-L1，存檔惡性良性腫瘤标本不一定反映複發或轉移性病變中的TME。
多種免疫細胞類型，主要是巨噬細胞、樹突狀細胞（DC），以及T細胞、NK細胞和B細胞，可表達PD-L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群體或免疫細胞的空間特征與臨床最相關。需要使用多重IHC技術進一步描述惡性良性腫瘤細胞與特定免疫細胞亞群的空間互相作用，以确定是否需要繼續将免疫細胞分類為一個更廣泛的類别，這需要更細緻、更複雜的分析。
其它生物标志物
臨床試驗表明，具有大量效應T細胞的惡性良性腫瘤對ICI治療更為敏感。有研究使用以IFN-γ為中心的基因表達特征來顯示使用抗PD-1抗體pembrolizumab治療的黑色素瘤患者的總體應答率（ORR）和無進展生存率（PFS）的相關性。與這些發現一緻，在NSCLC中進行的IMpower150試驗報告了一種T效應細胞（Teff）基因表達特征，由PD-L1、CXCL9和IFN-γ組成，當比較atezolizumab聯合化療比較單獨化療時，該特征對PFS有益。
此外，具有高突變負荷的惡性良性腫瘤患者從CI治療中獲得了更大的臨床益處。TMB和PD-L1 IHC的一緻性研究似乎表明，這些生物标記物是正交的，并獨立預測CI治療的益處。是以，pembrolizumab最近獲得了監管部門的準許，用于治療先前治療後有進展且無替代治療方案的不可切除或轉移性高TMB實體瘤。
随着對更具預測性的生物标志物的研究不斷深入，有必要擺脫單一分析方法，整合負責進行免疫反應的各種生物過程。初步的探索性分析表明，聯合生物标志物可以轉化為臨床益處。在Checkmate-026和Checkmate-227研究中，惡性良性腫瘤表達高水準PD-L1并具有高組織TMB狀态的患者從抗PD-1抗體nivolumab治療中獲得最大益處。OAK研究也報告了類似的結果。
免疫效應細胞的表型多樣性
許多研究已經描述了惡性良性腫瘤浸潤淋巴細胞及其空間分布與治療效益之間的關系。識别各種免疫效應細胞的空間分布需要通過功能分析來補充，如激活标記物和抗原反應性，通過分析惡性良性腫瘤樣本中CD8+T細胞TCR序列的内在抗惡性良性腫瘤反應性，表明識别自體惡性良性腫瘤的能力僅限于少數惡性良性腫瘤浸潤CD8+T細胞。更複雜的是，惡性良性腫瘤不同區域（中心與邊緣浸潤）的CD4+和CD8+T細胞群中可能存在顯著的TCR異質性，異質性的程度具有預後意義。
通常，三種不同的CD8+T細胞群體可根據共同的轉錄譜識别：
表達CC-趨化因子受體7（CCR7）和轉錄因子7（TCF7）的原始或記憶細胞；
穿孔素1（PRF1）、顆粒酶A（GZMA）和GZMB陽性的細胞毒性細胞；
“功能失調”的多樣性細胞群體，其特征是與耗竭狀态相關的标記物，如PD-1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。
這三個群體的相對比例似乎高度可變，不僅在不同的惡性良性腫瘤類型中如此，在相同組織學的惡性良性腫瘤中也是如此。轉錄譜和TCR測序資訊已被用于确定惡性良性腫瘤内CD8+細胞表型是否發生改變。初步模型表明，TME誘導的表型異質性功能失調細胞群從幼稚的CD8+細胞進化而來，而後者以不依賴TME的方式産生細胞毒性細胞。“功能失調”細胞庫中的細胞在多大程度上可以轉化為“細胞毒性”狀态目前尚不清楚，然而，了解這一點對于設計促進和觸發這種轉變的療法非常重要。
此外，在幾項研究中已經鑒定出對惡性良性腫瘤表達的新抗原具有特異性的惡性良性腫瘤内CD8+T細胞，但其隻是表型異質性總群體的一小部分。有趣的是，CD39似乎能夠區分惡性良性腫瘤特異性（高CD39）和旁觀者（低CD39）CD8+T細胞。其他表型和功能分析顯示，CD39+亞群共表達CD103以及PD-1、TIM3和CTLA-4，這些标記通常與耗竭狀态相關。CD39和CD103的共同表達依賴于通過TCR的長時間刺激和TGF-β的暴露。有趣的是，高水準的CD39+CD103+雙陽性細胞似乎轉化為鱗狀細胞頭頸癌患者的生存益處。
免疫效應細胞的空間分布
最新的研究分析了CD8+T細胞和MHCII類表達細胞（最可能的抗原呈遞細胞）之間的空間關系。在腎細胞癌患者中，TCF1+/CD8+T細胞優先共定位于MHC II類表達細胞的區域，而TCF1−/CD8+細胞在整個惡性良性腫瘤中呈彌散分布。TCF1+/CD8+細胞的發生率也與DC的發生率相關，而TCF1−/CD8+細胞沒有表現出這種相關性。有趣的是，含有TCF1+/CD8+T細胞和表達MHC II類APC高密度區域的惡性良性腫瘤具有更好的臨床療效，APC密集區可能為幹細胞樣CD8+T細胞分化為能夠維持抗惡性良性腫瘤免疫反應的效應細胞提供了惡性良性腫瘤内環境。
很明顯，成熟、活躍的樹突狀細胞向惡性良性腫瘤床的惡性良性腫瘤浸潤增加了免疫激活和活性免疫效應細胞的募集。準确識别和量化DCs具有重要價值，然而，标記物如CD11c、CD11b、CD163和MHC-II不是DC特異性的，并且在其他細胞類型如巨噬細胞上表達。DC可以促進或抑制新生免疫反應的觀察結果進一步增加了複雜性，因為目前還沒有有效的标記來區分兩種DC狀态。
在惡性良性腫瘤進展過程中，TME轉變為一種主動保護惡性良性腫瘤細胞免受免疫攻擊的環境，被認為具有惡性良性腫瘤保護功能的TME細胞包括T調節細胞（Treg）、惡性良性腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）、惡性良性腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）和髓系抑制細胞（MDSCs）。
惡性良性腫瘤保護作用通常通過分泌的細胞因子和趨化因子介導，這些細胞因子和趨化因子可防止免疫效應T細胞侵入惡性良性腫瘤床或使這些細胞功能失效，例如，TGF-β。TGB-β抑制劑和抗PD-L1抗體的聯合治療可導緻Teff的惡性良性腫瘤内滲透，将表型從“排除”改變為“炎性”，減少轉移并提高長期生存率。
MDSC是中性粒細胞和單核細胞樣髓樣細胞的異質群體，越來越多地被認為是各種癌症免疫抑制的關鍵媒體。在癌症患者中，循環MDSC數量的增加與晚期臨床分期、轉移性疾病發病率的增加和免疫抑制相關。除了免疫抑制功能外，MDSC還可以通過與惡性良性腫瘤細胞和周圍基質的複雜串擾積極塑造惡性良性腫瘤微環境，進而增加血管生成、惡性良性腫瘤侵襲和轉移。
惡性良性腫瘤細胞的内在抗性
目前，我們對于惡性良性腫瘤免疫治療的不同反應和耐藥機制的了解仍然有許多空白。雖然我們希望找到一顆靈丹妙藥，但可能的事實是，有許多機制有助于産生抵抗。雖然惡性良性腫瘤抑制因子（如p53）的突變增加了突變負荷，有助于放大新抗原的數量，并使惡性良性腫瘤對免疫系統更敏感，但這些突變也可以驅動抗原呈遞途徑和關鍵細胞機制的突變，進而觸發轉錄和代謝變化，進而對惡性良性腫瘤浸潤性免疫細胞産生間接影響。
惡性良性腫瘤抗原呈遞機制的一個關鍵組成部分是MHC I類分子，它由HLA I類（HLA-I）亞機關和β2微球蛋白（β2M）組成。MHC-I的下調存在于多種惡性良性腫瘤類型中，可能通過多種機制發生，包括基因突變、表觀遺傳沉默、轉錄變化和翻譯後修飾。
MHC-I的下調如何影響TME？研究發現，HLA-I陽性表達與免疫浸潤密度相關，與PD-L1狀态無關。所有HLA-I+/PD-L1+的惡性良性腫瘤都有高度的CD8+T細胞浸潤，而HLA-I缺失與惡性良性腫瘤内T淋巴細胞數量減少相關，其空間局限于惡性良性腫瘤周圍的基質。而HLA-I-/PD-L1-的惡性良性腫瘤較大，CD8+T細胞密度較低。這項研究表明，惡性良性腫瘤免疫逃逸表型結合了兩種獨立的免疫逃逸機制：HLA-I的丢失和PD-L1的上調。
新輔助治療中獲得經驗
最近對早期疾病免疫治療的探索為了解TME及其在治療反應中的變化提供了新的機會。新輔助研究特别豐富，因為治療前經常收集診斷性活檢，并可與新輔助治療後立即進行的手術切除進行比較。
ABACUS試驗是一項單臂2期研究，研究膀胱切除術前atezolizumab的新輔助治療。升高的PD-L1水準（SP142；IC≥5%）,基線Teff基因表達和上皮内CD8+T細胞與臨床益處相關。有趣的是，與術前相比，在治療後惡性良性腫瘤樣本中觀察到上皮内CD8+T細胞和PD-L1+免疫細胞的數量增加，并且這種增加在應答者中比在複發患者中更為明顯。在治療後樣本中發現，TGF-β、成纖維細胞活化蛋白和細胞周期基因升高與耐藥性相關。
PURE-01研究報告了類似的結果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除術前接受了三個周期的pembrolizumab。與PD-L1狀态較低的患者相比，PD-L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10%）獲得了更高的病理完全緩解率。與治療前活檢相比，治療後切除的PD-L1 CPS水準升高，TMB水準降低。此外，與治療前樣本相比，治療後樣本中的免疫相關基因（包括與IFN-γ信号、抗原呈遞和T細胞功能相關的基因）也有所增加。
NABUCCO研究評估了III期尿路上皮癌切除術前使用ipilimumab和nivolumab的效果。與ABACUS和PURE-01研究相比，治療結果與惡性良性腫瘤内CD8+T細胞浸潤或Teff信号的基線狀态無關。相反，研究觀察到，在獲得完全應答的患者中，TMB升高與DDR基因改變頻率升高之間存在一種趨勢。無法獲得完全應答的患者在基線樣本中富含TGF-β基因表達特征，表明可能存在耐藥機制。此外，還研究了TIL密度與反應之間的相關性，有趣的是，基線TIL與療效之間沒有相關性，但在治療後獲得CR的患者中觀察到TIL富集。
這些觀察結果并非膀胱癌所獨有。NEOSTAR試驗評估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作為可手術NSCLC患者的新輔助治療。獲得影像學或主要病理學反應的患者總體上比基線惡性良性腫瘤樣本的PD-L1更高。與單獨使用nivolumab治療相比，nivolumab加ipilimumab治療後TIL、組織駐留記憶T細胞、TEFF和效應記憶T細胞的頻率更高。
總體來說，基線PD-L1似乎可以預測ICI的反應。TMB、TIL和DDR等作為生物标志物也似乎很有希望，但需要進一步評估和驗證。治療方案的差異以及患者群體的異質性可能導緻不同試驗結果的不一緻。随着新輔助免疫治療和化療-免疫治療聯合方案獲得監管部門的準許，識别經驗證的生物标記物以預測免疫反應對于幫助作出治療決定至關重要。
随着從化療向靶向治療和免疫治療的過渡不斷發展，研究人員将采用更複雜的臨床試驗設計，如靶向治療和免疫治療的聯合，不同CI藥物的聯合，并且更加關注生物标記物的設計，這些生物标記物對預測單藥或多藥治療方案的反應或耐藥性具有更高的敏感性。
未來，很可能需要多參數的方法來确定最有可能對ICI治療有反應的患者，開發基于組織的強大複合技術非常重要。這有助于更準備地描述TME的特征，并分析惡性良性腫瘤和效應免疫細胞之間以及效應細胞和APC之間的互相作用。相關标記物的表達譜可能提示效應細胞的激活、抑制或耗竭狀态，并提示耐藥機制。
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