撰文 | 王彥文 責編 | 周葉斌
近年來，惡性良性腫瘤的治療方法已經從廣譜的細胞毒性藥物如化療，轉變為适用于個體患者的精準治療，治療效果得到大幅提升。精準治療依賴于對患者惡性良性腫瘤的分子和細胞層面的分析，然而，利用分子方法隻能在一小部分患者中發現可以成藥的惡性良性腫瘤驅動基因。對于那些不攜帶靶點突變或者惡性良性腫瘤突變負荷低的患者，就難以通過基因組分析來選擇合适的藥物。
這個問題普遍存在于兒童惡性良性腫瘤中，如橫紋肌肉瘤（RMS）。RMS是兒童中最常見的軟組織肉瘤，30%的患者臨床治療效果較差。到目前為止，RMS尚無靶向治療方法面世。這類惡性良性腫瘤患者急需更有效的藥物選擇方法。
2020年9月15日，由Gabriele Manzella等發表在Nature Communications的題為Phenotypic profiling with a living biobank of primary rhabdomyosarcoma unravels disease heterogeneity and AKT sensitivity的文章，闡述了其建構的一個功能性藥物發現平台。該平台優化了RMS細胞的生長培養條件，而且能夠實作精準地篩選患者特異性的藥物。
首先，研究對RMS細胞培養進行優化。作者選用了20種RMS人源性惡性良性腫瘤組織異種移植（PDX）來源的細胞（PDX-derivedprimary cells, PPCs），分别比較在多種不同培養基中的細胞活力、增殖能力、分化以及小鼠惡性良性腫瘤間質細胞的污染情況。其中，Neurobasal（NB）培養基結合一種黏附基質可以支援大多數PPCs的生長，而且表現出較低的小鼠間質細胞污染及低細胞分化。
長期的細胞增殖研究也發現，NB培養的細胞可以保持指數增殖。優化的培養基也能夠支援細胞的3D增殖。将體外培養的PPCs細胞及親代PDX細胞分别注射進NSG小鼠體内，兩種模型下植入率均達到了100%，而且惡性良性腫瘤的生長情況及荷瘤小鼠的存活率也都類似。說明這個平台能夠很好地支援異質性惡性良性腫瘤細胞的生長。
a. 臨床前藥物篩選平台的建立流程。b. PPCs培養基的優化。c.兩種PPCs在DMEM和加入生長因子的NB培養基上的生長曲線。
為評估培養條件是否會導緻克隆選擇，該研究對PDX和相對應的PPCs細胞進行了分子層面分析。全基因組拷貝數檢測、外顯子組測序、甲基化圖譜均發現PDX和PPCs存在高度一緻性，說明培養細胞的表觀遺傳和基因型都是穩定的。為了檢測培養的PPC細胞是否保留了惡性良性腫瘤的組織學特征，研究者将傳代4至6代的PPC細胞生成了異種移植物（CDX），發現CDX和PDX的組織學特征與原始RMS組織一緻。
随後，作者研究了體外培養的PPCs是否能用于個體化的藥物篩選。藥物篩選使用一個包含204種藥物的化合物庫，覆寫了一系列的靶點。将17個PPCs和4個已建立的細胞系分别用500 nM的各類藥物處理72小時後，約30.9%的藥物導緻至少一個樣本活性降低40%及以上。大多數藥物效應模式表現出患者特異性。其中，AKT和MEK抑制劑均表現出選擇性敏感性。進一步的實驗證明藥物毒性也不受培養狀态（2D還是3D）影響。
為使這個平台适用于臨床，研究者下一步将患者惡性良性腫瘤組織直接進行體外培養。研究者選用了RMS患者第二次複發後的淋巴結活體組織，其在添加了B27和bFGF的NB培養基中生長良好。藥物篩選結果發現的有效藥物包括蛋白酶體和HDAC抑制劑，證明PPCs藥物篩選平台還可以使用直接從患者惡性良性腫瘤中分離的細胞，這樣，使用更短的時間來在臨床上進行個性化藥物選擇成為了可能。
a. RMS患者臨床診斷，治療及藥物篩選流程。b. 患者淋巴結活檢分離出的細胞明場圖像。c. FOXO1基因熒光原位雜交檢測。d. 篩選藥物的活性。e. 左：Panobinostat 和bortezomib單獨和聯合使用對細胞活力的影響；右：Panobinostat 和bortezomib的協同作用。
篩選出的藥物中，AKT和MEK抑制劑表現出的患者特異性敏感性吸引了研究者的關注。研究者根據PPCs對藥物的反應将其分成了3個亞組，兩組對AKT或EKR抑制劑有響應，另外一組對兩者都沒有響應。為進一步了解機制，研究者用AKT抑制劑（afuresertib）和MEK抑制劑（trametinib）一起處理了8種PPCs培養物。兩種藥物在7種PPCs中呈現出協同作用，而這種協同作用在RAS突變的PPCs中更加明顯。當分别單獨用afuresertib和trametinib處理PPCs時，IC50表現出顯著的個體差異，其中對藥物最敏感的樣本的IC50已經達到了治療使用的濃度範圍。
為進一步驗證該藥物篩選平台的可靠性，研究者進行了體内研究：用afuresertib連續處理敏感和耐藥的PDX至少3個周期。結果證明，afuresertib敏感荷瘤小鼠的壽命明顯長于耐藥小鼠。研究者進一步給予afuresertib敏感小鼠afuresertib聯合trametinib，和體外結果一緻，也表現出協同作用。
綜上，本文的研究建構了一個針對橫紋肌肉瘤（RMS）的臨床前藥物篩選平台。在平台的建構驗證過程中，也揭示了RMS對不同藥物敏感的異質性。通過該平台還篩選出AKT、MEK抑制劑聯合可能對部分RMS患者有效。該結果為臨床藥物篩選提供了重要的理論基礎，相信未來可以用于為患者提供個性化的治療決策。
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排版 | Sheila 校對 | uu