十九世紀德川幕府統治的末期，長期實施鎖國政策的日本，開始被列強叩關，導緻在1854被迫開國。
面對開國的恥辱，日本國内反德川幕府統治的薩摩、長州、土佐、肥後等藩，打着尊王攘夷要推翻幕府的統治。有倒幕派也有支援幕府的勢力，會津藩主松平容保在京都就成立新撰組、京都見回組等組織，與以薩長土肥為首的維新志士相抗衡。
在紛亂的時代，坂本龍馬是其中閃亮的一員。慶應3年11月15日，他在近江屋的二樓與中岡慎太郎進行密商，刺客僞裝成十津川鄉士來拜訪龍馬，趁着龍馬及中岡坐着來不及反應的當下砍殺二人，龍馬的額頭與身上多處中刀，當夜死亡，得年31歲。
令人困惑的是，龍馬本身是劍術高手，不過遇刺當天，刀完全沒有拔出。而且他也有攜帶手槍，可是沒有發射過的迹象。對于龍馬居然一點抵抗迹象也沒有這點，實在令人難以了解！
關于暗殺龍馬是誰，常見有三種說法：
一、新撰組
新撰組是幕末時期一個親幕府的武裝集團，和見回組都是幕末負責維持京都治安的組織。在龍馬暗殺事件中，一起遇襲的中岡慎太郎多活了兩天，是以當問他有關犯人的事，中岡說下手的是新撰組。
因刺客口音帶有伊予腔，現場也遺留原田左之助的刀鞘等物證，加上兩天後被新選組肅清的筱原泰之進等禦陵衛士殘黨，都指稱此次暗殺是新撰組策劃，犯人為新撰組的原田左之助或大石鍬次郎等人所為。
這個說法普遍認同，大石之後就以暗殺龍馬之罪被殺，近藤勇被處決的其中一條罪名也有暗殺龍馬。
二、薩摩陰謀論
雖然一度龍馬和薩摩為親密的盟友，可是雙方的政治立場并不一直相同，幕末以武力倒幕和排除舊權力為目标的西鄉隆盛、大久保利通等人，與主張支援大政奉還的龍馬意見相左。
兩者差别在于，薩摩和長州兩藩支援的倒幕敕令，是希望可以在戰後，建立以薩長主導的政府。但大政奉還，則被認為還是以德川家為首的新聯合政權。薩長跟幕府有長期的仇恨，倒幕勤王對雙方來說隻是手段，目的都是為了奪權報仇。當大政奉還後，為了打擊幕府派，薩摩派将龍馬的行蹤洩漏給幕府中的死忠派，使得龍馬死亡。
三、京都見回組
京都見回組是幕末由幕臣所結成，其和新撰組皆專門用于取締反幕府勢力，維持京都治安的組織。雖然大政奉還是德川幕府高層推動支援的政策，但身為幕府内死忠派的見回組，并不認同龍馬的主張，認為大政奉還損害德川家的利益，進而暗殺龍馬。
目前的主流說法也認為，殺害坂本龍馬的是見回組的今井信郎，他于箱館戰争投降後，自白暗殺龍馬，下令的是與頭佐佐木隻三郎，原回組隊士渡邊笃在大正時代也提出證詞。目前，多數研究學者都認為執行暗殺的兇手就是見回組。
關于誰暗殺龍馬，還有最後一個說法，就是在當時龍馬其實隻是個小咖，暗殺的真正目标是中岡慎太郎，龍馬隻是剛好在場被潑及，這個說法在暗殺當下，也有不少人支援。
不過随着明治維新後，龍馬的地位越擡越高，是以龍馬才是暗殺目标的說法成為主流。