十九世纪德川幕府统治的末期，长期实施锁国政策的日本，开始被列强叩关，导致在1854被迫开国。
面对开国的耻辱，日本国内反德川幕府统治的萨摩、长州、土佐、肥后等藩，打着尊王攘夷要推翻幕府的统治。有倒幕派也有支持幕府的势力，会津藩主松平容保在京都就成立新撰组、京都见回组等组织，与以萨长土肥为首的维新志士相抗衡。
在纷乱的时代，坂本龙马是其中闪亮的一员。庆应3年11月15日，他在近江屋的二楼与中冈慎太郎进行密商，刺客伪装成十津川乡士来拜访龙马，趁着龙马及中冈坐着来不及反应的当下砍杀二人，龙马的额头与身上多处中刀，当夜死亡，得年31岁。
令人困惑的是，龙马本身是剑术高手，不过遇刺当天，刀完全没有拔出。而且他也有携带手枪，可是没有发射过的迹象。对于龙马居然一点抵抗迹象也没有这点，实在令人难以理解！
关于暗杀龙马是谁，常见有三种说法：
一、新撰组
新撰组是幕末时期一个亲幕府的武装集团，和见回组都是幕末负责维持京都治安的组织。在龙马暗杀事件中，一起遇袭的中冈慎太郎多活了两天，所以当问他有关犯人的事，中冈说下手的是新撰组。
因刺客口音带有伊予腔，现场也遗留原田左之助的刀鞘等物证，加上两天后被新选组肃清的筱原泰之进等御陵卫士残党，都指称此次暗杀是新撰组策划，犯人为新撰组的原田左之助或大石锹次郎等人所为。
这个说法普遍认同，大石之后就以暗杀龙马之罪被杀，近藤勇被处决的其中一条罪名也有暗杀龙马。
二、萨摩阴谋论
虽然一度龙马和萨摩为亲密的盟友，可是双方的政治立场并不一直相同，幕末以武力倒幕和排除旧权力为目标的西乡隆盛、大久保利通等人，与主张支持大政奉还的龙马意见相左。
两者差别在于，萨摩和长州两藩支持的倒幕敕令，是希望可以在战后，建立以萨长主导的政府。但大政奉还，则被认为还是以德川家为首的新联合政权。萨长跟幕府有长期的仇恨，倒幕勤王对双方来说只是手段，目的都是为了夺权报仇。当大政奉还后，为了打击幕府派，萨摩派将龙马的行踪泄漏给幕府中的死忠派，使得龙马死亡。
三、京都见回组
京都见回组是幕末由幕臣所结成，其和新撰组皆专门用于取缔反幕府势力，维持京都治安的组织。虽然大政奉还是德川幕府高层推动支持的政策，但身为幕府内死忠派的见回组，并不认同龙马的主张，认为大政奉还损害德川家的利益，进而暗杀龙马。
目前的主流说法也认为，杀害坂本龙马的是见回组的今井信郎，他于箱馆战争投降后，自白暗杀龙马，下令的是与头佐佐木只三郎，原回组队士渡边笃在大正时代也提出证词。目前，多数研究学者都认为执行暗杀的凶手就是见回组。
关于谁暗杀龙马，还有最后一个说法，就是在当时龙马其实只是个小咖，暗杀的真正目标是中冈慎太郎，龙马只是刚好在场被泼及，这个说法在暗杀当下，也有不少人支持。
不过随着明治维新后，龙马的地位越抬越高，所以龙马才是暗杀目标的说法成为主流。