文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
本次探究青花椒雄蕊分化关键B类基因及其核酸和蛋白序列特性。
并分析其在雌雄花分化过程的表达模式,为青花椒花芽性别分化的遗传调控机制提供候选基因和数据支撑。
基于青花椒转录组和基因组数据库，提取雌雄花分化过程中差异表达的所有B类MADS-box家族基因，并分析获取关键成员。
克隆关键成员基因编码序列，全面剖析核酸和蛋白序列特性；并解析其在11种不同组织器官以及雌雄花分化过程的表达模式。
青花椒基因和遗传调控机制
青花椒，又名竹叶花椒，为芸香科多年生小乔木或灌木。常见的青花椒主要为纯雌株，聚伞状圆锥花序，单性不完全花中缺少花瓣，以无融合生殖为主要繁殖方式。
因其特殊的清香麻味而受到消费者青睐，是一种重要香料、油料、制药兼用型经济树种，亦是大陆西部地区乡村振兴的支柱产业之一，具有较高的研究和经济价值。
然而，近年来的野外观察发现青花椒中出现大量雄花，且具有逐年增多趋势，导致以孤雌生殖繁殖的青花椒结实产量显著降低，严重影响其产业化推广应用。
因此，探究青花椒花芽性别分化的关键调控基因，是揭示青花椒花芽性别分化的遗传调控机制，解析青花椒雄花形成内在原因的重要前提。
对于研发雄花防控的性别调控技术和培育优质高产青花椒种质资源具有重要意义。
已有研究表明，被子植物花的结构大致保守，由外向内依次由萼片、花瓣、雄蕊和心皮四轮花器官组成，并受到A、B、C3类功能基因的联合控制。
花器官分化ABC模型的大多数基因都属于MADS家族成员，其编码的蛋白主要由MADS-box、I间隔区、K-box和C末端4个保守程度不同的结构域组成，故又称为MIKC型转录因子。
其中，B类基因为APETALA3/PISTILLATA亚家族成员，主要涉及雄蕊的分化过程，并能够和A类基因协同调控花瓣的发育。
已有多项研究分别报道了B类基因在花卉、蔬菜、水果、木本植物等不同类型植物中均具有调控雄蕊分化的重要作用。
然而，尽管PI同源基因在部分物种中已研究的十分透彻，但不同物种的PI基因数量和调控效果存在差异。
专家研究表明，拟南芥中共鉴定到3个PI/AP3家族成员，其中pi-1的调控作用最为明显。与此类似，雪香兰的7个PI/AP3家族成员中，HoPI_3能够显著调控雄花序的分化形成。
目前，有关青花椒花芽性别分化过程中的关键调控基因和遗传调控机制未见报道。
因此，探究青花椒PI/AP3家族的重要调控基因及其遗传学信息，对于揭示青花椒雄蕊形成分子机制具有重要意义。
本次结合课题组前期已有的青花椒雌雄花分化过程的转录组数据库，筛选并获取了调控青花椒雄蕊分化的重要PI基因。
并结合基因组数据成功克隆了该基因的编码序列全长，开展了青花椒ZaPI的核酸和蛋白序列特征分析，解析了响应青花椒ZaPI的转录因子和顺式作用元件。
同时，结合转录组数据和qRT-PCR技术，综合性明确了ZaPI基因在青花椒根、茎、叶、刺等11种不同组织器官以及雌雄花分化10个时间点的表达模式。
所获研究结果为探索青花椒雄蕊形成的分子机制，研发雄花防控的性别调控技术提供了丰富的理论基础和数据支撑。
青花椒ZaPI基因表达模式分析
为了综合揭示ZaPI基因在青花椒中的组织特异性表达模式，本研究从课题组前期已有的转录组数据集中提取ZaPI在根、茎、成熟叶、果实和叶芽共计5个样品中的表达丰度。
同时，从NCBI已公开的青花椒转录组数据中，分析获取了ZaPI在幼花、幼叶、果皮、种子、顶芽和皮刺共计6个样品的表达丰度,所有样品的RNA-seq数据均有3次生物学重复。
同时，分别采集青花椒雌雄花分化10个分化时间点样品，利用RNA快速提取试剂盒提取各样品的RNA，并反转录获得cDNA。
根据本次所获ZaPI编码序列，利用PrimerPremier5设计特异性定量检测引物，利用qRT-PCR检测ZaPI基因在各样品中的表达模式。
以雌花分化第一个样品为对照，利用2-ΔΔCt法计算不同样品中ZaPI基因的相对表达水平，采用Duncan多重比较进行不同样品间PI相对表达量的差异分析，显著性水平为P＜0.05，利用GraphPadPrism5绘制柱形图。
从青花椒雌雄花分化的差异表达基因集中共获得11个AP3/PI家族成员，其中包括3个ZaPI基因和8个ZaAP3基因。
基因表达模式分析表明，所获差异基因均在雄蕊成熟期显著上调，而在雌花分化过程中表达量较低。
同时，Zardc17043在雄花M4时期的表达量是其他差异基因的15-90倍，且在雄花分化过程中呈现极显著上调的高表达。
上述结果表明，Zardc17043可能是参与青花椒雄花调控的AP3/PI家族重要成员。因此，本研究选取该基因作为青花椒雄蕊分化的关键调控基因进行后续分析和研究。
通过与其他物种PI基因比对分析发现，从青花椒基因组数据库中所得Zardc17043编码序列长度仅426bp，缺失C-端蛋白结构域。
然而，青花椒不同组织的无参转录组数据库中所得同源基因Cluster-12235.70400的预测编码序列长度为769bp，与Zardc17043存在较高的同源性，但缺少蛋白翻译的起始密码子。
因此，本研究将两者拼接，成功获得了一条长度为624bp的编码序列，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，共编码207个氨基酸，初步确定为青花椒Zardc17043的编码序列全长。
为明确上述分析结果的准确性，本研究利用青花椒雄花的cDNA为模板进行了多次PCR扩增。
结果表明，除序列N端存在一个氨基酸突变外，其余PCR扩增序列与上述拼接所得序列完全一致。
此外，不同物种的PI蛋白序列比对结果表明，ZaPI蛋白含有典型的MADS-box和K-box结构域，并具有相对完整的C端转录激活区。
青花椒ZaPI的转录因子结合位点
为了更好地了解青花椒ZaPI基因的潜在功能和调控基因，利用PlantRegMap软件对其进行预测。
获得包括BR-BPC、MIKC_MADS、C2H2、MYB等17类转录因子家族的54个结合位点，其中BR-BPC的结合位点数量最多，共10个，占19%；其次是MIKC_MADS，共9个，占17%。
这些转录因子与调控植物生殖生长、生理代谢、细胞分化等生长发育过程显著相关，暗示ZaPI可能与这些转录因子相互作用，调控青花椒雄蕊的分化过程。
除启动子本身具有的CAAT-box和TATA-box等特征性元件外，还包括6类响应元件，分别是占比9%的激素响应元件、8%的光反应元件、7%的MYB响应元件、3%的厌氧诱导调节元件以及2%的防御与应激反应元件和分生组织表达响应元件。
该结果表明，ZaPI基因可能存在多种信号响应模式，参与了青花椒不同的生命活动过程，是潜在植物激素和光信号响应因子。
可能受到MYB转录因子的互作调控，并在逆境条件下调控植物生殖生长过程中发挥着重要作用。
组织特异性分析结果表明，青花椒ZaPI在根茎叶刺等10种不同组织器官中几乎不表达，仅在果实中表达量相对较高。
此外，为进一步明确本研究所选ZaPI基因在青花椒性别分化过程的表达情况，本研究利用雌雄蕊分化的10个时间点样品进行了qRT-PCR检测分析。
结果表明，青花椒ZaPI基因在雌雄花分化过程中存在极显著差异。ZaPI主要在雄花中表达，并随着雄蕊的分化表达量逐渐上调。
在12月雄蕊形成期和2-3月份雄蕊成熟期表达量显著提高，尤其是后者的表达量呈指数级上调。然而，ZaPI在青花椒整个雌花分化过程的表达量持续处于相对较低水平。
上述结果与B类基因的基本功能吻合，表明本研究所获ZaPI基因在青花椒雄花分化过程中具有重要的调控作用。
本次结合青花椒转录组和基因组数据，成功克隆了一条长度为624bp的ZaPI基因完整编码序列。
并利用蛋白结构域分析、系统进化树构建、染色体定位、转录因子结合位点及顺式作用元件预测等方法对其进行了综合的生物信息学分析。
发现ZaPI基因可能响应植物激素、光照以及逆境胁迫等信号通路，调节青花椒的花器官分化过程。
此外，转录组学和实时荧光定量PCR分析结果表明，该基因在青花椒营养器官中几乎不表达，雌花分化过程的表达量也相对较低。
但在雄花分化过程中表达量极显著上调，暗示其可能显著参与了青花椒雄蕊分化的遗传调控过程。
本次所获结果，对于进一步探究青花椒雄蕊形成的分子机制，培育高产青花椒种质资源提供了丰富的理论支撑