常見菌株的複蘇與活化方法

一、制定方案

當我們獲得一株菌，在進行複蘇活化之前，首先要了解菌株的生長特性，确定菌株的營養需求、生長溫度、氣體環境、滲透壓、酸堿度及嗜鹽性等條件，選擇合适的培養基和培養環境，制定複蘇活化方案。通常從菌種保藏中心購買的菌株都附帶說明書，按照說明書進行操作即可。若沒有說明書，可通過查閱文獻（推薦檢視伯傑細菌手冊或常見細菌鑒定手冊）等方式确認菌株的生長條件，再制定方案。

二、菌株處理及接種操作

獲得菌株後，原則上應盡早進行活化和儲存。若不能立即活化，應按照說明書放入相應的環境中進行儲存。

（1）若儲存的菌株為凍幹粉形式或載體儲存形式，可加入少量生理鹽水或非選擇性肉湯培養基進行溶解懸浮，用劃線或塗布方式接種至平闆，或吸取菌液至液體培養基中進行培養。

（2）若儲存的菌株為甘油凍存或液體儲存形式，可在室溫速融後劃線或塗布接種至平闆，或直接加入到液體培養基中進行培養。

（3）若儲存的菌株為瓷珠形式，可以挑取單個瓷珠在平闆上滾動數次或直接加入到液體培養基中進行培養。

（4）若儲存的菌株為斜面或半固體形式，可直接挑取菌苔轉接至平闆或液體培養基中進行培養。

三、培養基的選擇

1、活化菌株使用的培養基的成分通常包括以下幾個組分：

（1）基本營養成分：如蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉等，主要提供碳源、氮源及微量元素等；

（2）氯化鈉：維持一定的滲透壓環境；

（3）磷酸鹽：維持pH的相對穩定；

（4）特殊成分：如血清、半胱氨酸、氯化血紅素等，促進特定菌的生長。根據菌株的生長特性，選擇合适的培養基或對特定的培養基添加成分進行改良，以滿足菌株的生長需求。

2、常用活化培養基有以下幾種：

（1）胰酪大豆胨液體/瓊脂培養基、營養肉湯/瓊脂培養基、腦心浸液肉湯/瓊脂培養基：營養豐富，适用于多數常見細菌的複蘇活化培養。

注：可在培養基中加入血液、血清、維生素、氯化血紅素等成分增加營養，培養一些營養苛求的細菌。

（2）血平闆：可使用血液瓊脂基礎加入5%-10%的脫纖維羊血或兔血，也可使用TSA或BHI等培養基做為基礎加入5%-10%的脫纖維羊血或兔血制成血平闆，可以培養一些營養要求較高的細菌，如彎曲菌、嗜血杆菌、奈瑟氏菌、梭菌、鍊球菌、螺杆菌等。

（3）巧克力平闆：與血平闆不同的是，利用輕微加熱使血液中的紅細胞裂解釋放出内部各種生長因子，制成的平闆呈巧克力色，該培養基常用于嗜血杆菌、奈瑟氏菌、鍊球菌的培養。

（4）MRS肉湯/瓊脂：偏酸的pH和較高的糖含量，适合乳酸菌的生長，常用于乳杆菌、乳球菌、雙歧杆菌等乳酸菌的培養。

（5）2216E液體/瓊脂培養基：與海水相似的成分和滲透壓，常用于海生細菌的培養，如副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等，在含3%左右鹽度的培養基中生長旺盛。

（6）疱肉培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基：常用于厭氧梭菌的培養，如産氣莢膜梭菌、生孢梭菌等。

注：使用液體培養基培養厭氧菌時，在培養基表面覆寫液體石蠟隔絕空氣，無需放入厭氧培養箱中，可直接培養厭氧菌（硫乙醇酸鹽流體培養基可自然形成厭氧環境，無需覆寫液體石蠟，也無需厭氧培養）。

（7）BCYE：專用于軍團菌的培養。

（8）沙氏葡萄糖液體/瓊脂培養基：較高的糖含量有利于真菌的生長，常用來培養黴菌、酵母菌等真菌。

（9）支原體肉湯、精氨酸支原體肉湯：需加入血清，用于培養肺炎支原體、口腔支原體等。

（10）ISP2、高氏1号培養基：常用于放線菌的培養。

（11）GAM培養基：該培養基營養較高，可用于多種需氧厭氧菌的培養，如拟杆菌、梭菌、雙歧杆菌等。

（12）羅氏培養基、Middle Brook 7H10：用于分枝杆菌的培養。

注：活化菌株時，通常不宜使用帶有抑菌作用的選擇性培養基，如金黃色葡萄球菌活化可使用TSA/TSB，但通常不宜使用甘露醇氯化鈉瓊脂、Baird-parker瓊脂等選擇性平闆進行活化。

四、培養條件

（1）溫度：大多數細菌最适生長溫度在30-37℃，真菌和放線菌最适生長溫度在20-30℃，彎曲菌最适生長溫度為42℃，嗜熱菌最适生長溫度在55℃左右或更高，嗜冷菌通常在20℃以下生長。

（2）氣體環境

專性需氧型：如銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌等，需要有氧氣才能生長，在正常的空氣中培養即可。

兼性厭氧型：如大腸杆菌、沙門氏菌等，有氧無氧均可生長良好，在正常的空氣中培養即可。

專性厭氧型：如雙歧杆菌、梭菌、拟杆菌等，氧氣對這些細菌會産生毒害作用，抑制生長，是以需在專用的厭氧培養箱或厭氧罐中進行培養。多數厭氧菌需5%的二氧化碳促進生長。

微需氧型：如彎曲菌、螺杆菌等，适合在5%-10%氧氣的環境中生長，需在微需氧培養箱或培養罐中進行培養。

二氧化碳：一些細菌的初次培養或分離需要二氧化碳環境促進生長，如肺炎鍊球菌、軍團菌等。

（3）其他條件：如光合細菌需要光照等。

五、常見細菌的推薦活化培養方式

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菌株名稱

活化培養方式

大腸埃希氏菌、沙門氏菌、枯草芽孢杆菌、蠟樣芽胞杆菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、變形杆菌、阪崎腸杆菌、李斯特氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、腸球菌、嗜水氣單胞菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌等

TSA/TSB或NA/NB，30-36℃培養18-24h

白色念珠菌、釀酒酵母等

SDA/SDB/PDA，20-25℃培養3-5天

黑曲黴

SDA/PDA，20-25℃培養5-7天或培養至産黑色孢子

白色鍊黴菌

ISP2培養基28-30℃培養3-5天

産氣莢膜梭菌、生孢梭菌、艱難梭菌

硫乙醇酸鹽流體培養基或疱肉培養基30-36℃培養24-48h，或血平闆、哥倫比亞平闆30-36℃厭氧培養24-48h。

注：梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養基中存活時間較短，可使用疱肉培養基儲存較長時間。

植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌嬰兒雙歧杆菌、嗜熱鍊球菌等

MRS瓊脂/肉湯36±1℃培養24-48h（雙歧杆菌需厭氧培養）

副溶血性弧菌、創傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等

2216E液體/瓊脂培養基或3%氯化鈉TSA，30-36℃培養18-24h

肺炎鍊球菌、溶血性鍊球菌

血平闆36±1℃培養24-48h

藤黃微球菌

TSA或營養瓊脂30-36℃培養24-48h

空腸彎曲菌、結腸彎曲菌等

血平闆42℃微需氧培養24-48h

腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等

血平闆或巧克力平闆，36±1℃培養24-72h，奈瑟菌初次分離通常需5%-10%二氧化碳環境

脆弱拟杆菌

血平、GAM或BBE36±1℃厭氧培養24-48h

口腔支原體、肺炎支原體

精氨酸支原體肉湯（口腔）或支原體肉湯（肺炎）36±1℃培養3-7天，初代複活通常比較難培養，有時需數周時間，中間還需進行盲傳2次，在含5%-10%的二氧化碳環境更易培養

博茲曼軍團菌、嗜肺軍團菌等

BCYE36±1℃培養3-7天，初代培養在5%二氧化碳環境中生長更好

菌株複蘇操作視訊： https://www.ixigua.com/6862566424200937987

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