常见菌株的复苏与活化方法

一、制定方案

当我们获得一株菌，在进行复苏活化之前，首先要了解菌株的生长特性，确定菌株的营养需求、生长温度、气体环境、渗透压、酸碱度及嗜盐性等条件，选择合适的培养基和培养环境，制定复苏活化方案。通常从菌种保藏中心购买的菌株都附带说明书，按照说明书进行操作即可。若没有说明书，可通过查阅文献（推荐查看伯杰细菌手册或常见细菌鉴定手册）等方式确认菌株的生长条件，再制定方案。

二、菌株处理及接种操作

获得菌株后，原则上应尽早进行活化和保存。若不能立即活化，应按照说明书放入相应的环境中进行保存。

（1）若保存的菌株为冻干粉形式或载体保存形式，可加入少量生理盐水或非选择性肉汤培养基进行溶解悬浮，用划线或涂布方式接种至平板，或吸取菌液至液体培养基中进行培养。

（2）若保存的菌株为甘油冻存或液体保存形式，可在室温速融后划线或涂布接种至平板，或直接加入到液体培养基中进行培养。

（3）若保存的菌株为瓷珠形式，可以挑取单个瓷珠在平板上滚动数次或直接加入到液体培养基中进行培养。

（4）若保存的菌株为斜面或半固体形式，可直接挑取菌苔转接至平板或液体培养基中进行培养。

三、培养基的选择

1、活化菌株使用的培养基的成分通常包括以下几个组分：

（1）基本营养成分：如蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉等，主要提供碳源、氮源及微量元素等；

（2）氯化钠：维持一定的渗透压环境；

（3）磷酸盐：维持pH的相对稳定；

（4）特殊成分：如血清、半胱氨酸、氯化血红素等，促进特定菌的生长。根据菌株的生长特性，选择合适的培养基或对特定的培养基添加成分进行改良，以满足菌株的生长需求。

2、常用活化培养基有以下几种：

（1）胰酪大豆胨液体/琼脂培养基、营养肉汤/琼脂培养基、脑心浸液肉汤/琼脂培养基：营养丰富，适用于多数常见细菌的复苏活化培养。

注：可在培养基中加入血液、血清、维生素、氯化血红素等成分增加营养，培养一些营养苛求的细菌。

（2）血平板：可使用血液琼脂基础加入5%-10%的脱纤维羊血或兔血，也可使用TSA或BHI等培养基做为基础加入5%-10%的脱纤维羊血或兔血制成血平板，可以培养一些营养要求较高的细菌，如弯曲菌、嗜血杆菌、奈瑟氏菌、梭菌、链球菌、螺杆菌等。

（3）巧克力平板：与血平板不同的是，利用轻微加热使血液中的红细胞裂解释放出内部各种生长因子，制成的平板呈巧克力色，该培养基常用于嗜血杆菌、奈瑟氏菌、链球菌的培养。

（4）MRS肉汤/琼脂：偏酸的pH和较高的糖含量，适合乳酸菌的生长，常用于乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌等乳酸菌的培养。

（5）2216E液体/琼脂培养基：与海水相似的成分和渗透压，常用于海生细菌的培养，如副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等，在含3%左右盐度的培养基中生长旺盛。

（6）疱肉培养基、硫乙醇酸盐流体培养基：常用于厌氧梭菌的培养，如产气荚膜梭菌、生孢梭菌等。

注：使用液体培养基培养厌氧菌时，在培养基表面覆盖液体石蜡隔绝空气，无需放入厌氧培养箱中，可直接培养厌氧菌（硫乙醇酸盐流体培养基可自然形成厌氧环境，无需覆盖液体石蜡，也无需厌氧培养）。

（7）BCYE：专用于军团菌的培养。

（8）沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基：较高的糖含量有利于真菌的生长，常用来培养霉菌、酵母菌等真菌。

（9）支原体肉汤、精氨酸支原体肉汤：需加入血清，用于培养肺炎支原体、口腔支原体等。

（10）ISP2、高氏1号培养基：常用于放线菌的培养。

（11）GAM培养基：该培养基营养较高，可用于多种需氧厌氧菌的培养，如拟杆菌、梭菌、双歧杆菌等。

（12）罗氏培养基、Middle Brook 7H10：用于分枝杆菌的培养。

注：活化菌株时，通常不宜使用带有抑菌作用的选择性培养基，如金黄色葡萄球菌活化可使用TSA/TSB，但通常不宜使用甘露醇氯化钠琼脂、Baird-parker琼脂等选择性平板进行活化。

四、培养条件

（1）温度：大多数细菌最适生长温度在30-37℃，真菌和放线菌最适生长温度在20-30℃，弯曲菌最适生长温度为42℃，嗜热菌最适生长温度在55℃左右或更高，嗜冷菌通常在20℃以下生长。

（2）气体环境

专性需氧型：如铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等，需要有氧气才能生长，在正常的空气中培养即可。

兼性厌氧型：如大肠杆菌、沙门氏菌等，有氧无氧均可生长良好，在正常的空气中培养即可。

专性厌氧型：如双歧杆菌、梭菌、拟杆菌等，氧气对这些细菌会产生毒害作用，抑制生长，因此需在专用的厌氧培养箱或厌氧罐中进行培养。多数厌氧菌需5%的二氧化碳促进生长。

微需氧型：如弯曲菌、螺杆菌等，适合在5%-10%氧气的环境中生长，需在微需氧培养箱或培养罐中进行培养。

二氧化碳：一些细菌的初次培养或分离需要二氧化碳环境促进生长，如肺炎链球菌、军团菌等。

（3）其他条件：如光合细菌需要光照等。

五、常见细菌的推荐活化培养方式

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菌株名称

活化培养方式

大肠埃希氏菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、变形杆菌、阪崎肠杆菌、李斯特氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、肠球菌、嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌等

TSA/TSB或NA/NB，30-36℃培养18-24h

白色念珠菌、酿酒酵母等

SDA/SDB/PDA，20-25℃培养3-5天

黑曲霉

SDA/PDA，20-25℃培养5-7天或培养至产黑色孢子

白色链霉菌

ISP2培养基28-30℃培养3-5天

产气荚膜梭菌、生孢梭菌、艰难梭菌

硫乙醇酸盐流体培养基或疱肉培养基30-36℃培养24-48h，或血平板、哥伦比亚平板30-36℃厌氧培养24-48h。

注：梭菌在硫乙醇酸盐流体培养基中存活时间较短，可使用疱肉培养基保存较长时间。

植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌婴儿双歧杆菌、嗜热链球菌等

MRS琼脂/肉汤36±1℃培养24-48h（双歧杆菌需厌氧培养）

副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌等

2216E液体/琼脂培养基或3%氯化钠TSA，30-36℃培养18-24h

肺炎链球菌、溶血性链球菌

血平板36±1℃培养24-48h

藤黄微球菌

TSA或营养琼脂30-36℃培养24-48h

空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等

血平板42℃微需氧培养24-48h

脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等

血平板或巧克力平板，36±1℃培养24-72h，奈瑟菌初次分离通常需5%-10%二氧化碳环境

脆弱拟杆菌

血平、GAM或BBE36±1℃厌氧培养24-48h

口腔支原体、肺炎支原体

精氨酸支原体肉汤（口腔）或支原体肉汤（肺炎）36±1℃培养3-7天，初代复活通常比较难培养，有时需数周时间，中间还需进行盲传2次，在含5%-10%的二氧化碳环境更易培养

博兹曼军团菌、嗜肺军团菌等

BCYE36±1℃培养3-7天，初代培养在5%二氧化碳环境中生长更好

菌株复苏操作视频： https://www.ixigua.com/6862566424200937987

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