圖檔來源：Aimee Silla
如今，包括蛙類在内，兩栖動物的滅絕速度超過了世界上的任何其他脊椎動物。科學家和環保人士為它們建立了多個人工繁殖基地，卻依舊無法緩解這種趨勢。如何使瀕危物種中僅剩的幾隻繁殖後代，緩解物種危機成為新的難題。但随着育種技術的發展和人造栖息地的多樣化，未來或許我們還能聽到一些瀕危蛙類的叫聲。
大量蛙類步入瀕危
幾年前，我意外地收到了朋友的一封郵件。這位朋友是蛙類愛好者，他在郵件中寫道：“Toughie死了。”Toughie是一隻巴拿馬樹蛙（Rabb's fringe-limbed tree frog），這隻樹蛙曾在全球擁有衆多的粉絲，而我也是其中之一。Toughie長得非常可愛，但它卻因為一個殘酷的事實而出名：它是世界上最後一隻巴拿馬樹蛙。作為滅絕危機中種群的唯一幸存者，Toughie經曆了衆星捧月但又十分短暫的一生。
Toughie（圖檔來源：wikipedia）
2005年，一個動物保護小組從巴拿馬一處偏遠的雲霧森林中，捕獲了Toughie和另外4隻巴拿馬樹蛙，并将它們帶到美國進行人工繁殖，希望以此來阻止巴拿馬樹蛙的滅絕。由于蛙壺菌的感染，該物種很快就從野外消失了，随後人工繁殖也宣告失敗。到2012年，Toughie成了最後的幸存者，而它也于2016年9月去世。雖然我們早就知道Toughie終将離去，但這并不能夠減輕我們受到的打擊。
今年，我一直關注着一隻來自玻利維亞的西溫克斯水蛙（Sehuencas water frog）的命運。這隻英俊的水蛙名叫Remeo（羅密歐），十年來獨自生活在玻利維亞的科恰班巴自然曆史博物館的水族館裡。它曾反複嘗試尋找伴侶，但均未成功。2017年底，Remeo放棄了對異性的呼喚，它似乎注定要面臨與Toughie相同的命運。幸運的是，由于網絡上其他人的幫助，這隻西溫克斯水蛙有了避免孤獨終老的機會。
去年情人節的那天，Remeo的飼養員在網站上釋出了Remeo的資料。這一舉動帶來的大量捐款，資助和支援了另一支探險隊的野外水蛙尋找工作。今年1月，博物館宣布探險隊發現了5隻水蛙，其中包括2隻雌性。鑒于野外黯淡的生存前景，探險隊把它們帶回了水族館。Remeo終于找到了屬于自己的另一半，而它被取名為Juliet（朱麗葉）。
Remeo（圖檔來源：美國實體學會）
每個春天，我家後院的青蛙似乎會抓住一切機會大量産卵，是以我天真地猜測Remeo的“婚後”生活也會十分順利，并熱切期待着小蝌蚪們的消息。然而結果不容樂觀，被圈養的水蛙似乎并沒有太大的繁殖熱情。如果西溫克斯水蛙這樣的瀕危動物不進行交配産卵，怎樣才能拯救它們呢？
對于蛙和蟾蜍來說，我們可以用生殖技術來解決這一問題。随着兩栖動物激素療法、人工受精和冷凍儲存技術的迅速發展，人工圈養蛙類誕下健康後代的機率也開始提高。而目前受益于這些技術的瀕危物種還很少，但正如澳洲伍倫貢大學的生殖生物學家Aimee Silla所說，這些技術預計能為更多的瀕危動物提供幫助。Silla和同僚Phillip Byrne在《動物生物科學年度評論》中報道了該領域取得的成就。她說：“這些技術具有很大的應用潛力，而且激動人心的突破層出不窮，是以我們有理由保持樂觀。”
地球上的生物多樣性正在以空前的速度削減，而兩栖動物首當其沖，其數量減少速度超過了任何脊椎動物群體。2017年，世界自然保護聯盟（IUCN）列出了大約2100種瀕臨滅絕的兩栖動物，幾乎占已知兩栖動物物種的32％。根據IUCN的估計，這一數字可能還會繼續上升至55％左右。
其實我們很熟悉兩栖動物數量銳減的幕後元兇——栖息地消失、氣候變化、環境污染、被作為食物過度掠取和愈演愈烈的野生動物貿易。但現在還加上有史以來最嚴重的兩栖動物傳染病，即壺菌病（chytridiomycosis）。最近，科學家對該病的影響進行了評估，結果表明，這種可怕的真菌感染疾病導緻了500多種兩栖動物的數量減少，更有90種兩栖動物是以滅絕。
20世紀80年代後期，爬蟲學家首先敲響了物種滅絕的警鐘，并最終促成了科學界對蛙類、蟾蜍及它們的近親進行的全球評估。2004年釋出的結果令人震驚：各地的兩栖動物數量都在直線下降，一些物種甚至已經消失。2005年，國際專家舉行了一次峰會，以制定相應的保護措施。其中一項重要的提議是，動物園、水族館和其他有能力的組織應設法“拯救”瀕危物種和進行圈養繁殖。
倘若一切順利，這些“人造保護性栖息地”将在一定程度上保留瀕危物種的遺傳多樣性。如果有合适的栖息地，剩餘的後代可以被放歸野外，幫助增加或者恢複日漸減少的種群數量。
在這項計劃中，許多環境保護人士帶回了珍稀的蛙和蟾蜍，被圈養的兩栖動物數量激增。其中的一些繁殖計劃取得了巨大的成功。例如，馬略卡島産婆蟾（Mallorcan midwife toad）已在野外重建立立了18個繁殖種群，脫離了瀕危物種的清單。坦尚尼亞的奇罕西噴霧蟾蜍（Kihansi spray toad）于2009年被宣布在野外滅絕，因為當地的一個水利項目破壞了它們在奇罕西峽谷瀑布旁的、充滿水霧的栖息地。于是人們設法為圈養繁殖的噴霧蟾蜍，制造了适合生存的水霧環境，而這一努力也得到了回報，成千上萬人工飼養的噴霧蟾蜍被放歸到了奇罕西峽谷的人造水霧栖息地中。
馬略卡島産婆蟾。（圖檔來源：維基百科）
輔助生殖技術
但對于其他許多被拯救的物種來說，情況就不太樂觀了。有些物種無法産生卵子或精子，或雌雄個體産生配子的時間不同步；有些物種不能進行必要的交配行為；還有少數物種産生了胚胎，但胚胎很難進一步發育。密西西比州立大學的保護生物學家Andy Kouba曾研究過一些美國最罕見的兩栖動物，他表示，現在除了滅絕危機外，還存在圈養繁殖危機。
為什麼對兩栖動物繁殖後代如此艱難？很大程度上，這主要因為我們不夠了解稀有物種繁殖的苛刻要求。蛙和蟾蜍是極其多樣化的動物，通常具有許多高度分化的繁殖政策和習性。它們有些在水中繁殖，包括平靜的湖泊、湍急的溪流及淺淺的水池；另一些則在陸地上繁殖，從熱帶雨林的地面和樹冠，高山沼澤的苔藓下到蘆葦叢的泡沫水池中。它們多數會通過體外受精方式繁殖，但也有一小部分是體内受精。有些是一夫一妻制，有些則采用非常混亂的多對多交配方式。
更重要的是，與交配有關的生理和行為變化會與一系列環境和社會因素相聯系，包括濕度、溫度或壓力的變化，更明亮、更長的白晝，同伴的呼喚，冬眠的結束，或一場突如其來、标志着雨季開始的傾盆大雨。一旦某個物種瀕臨滅絕，我們就幾乎沒有機會在野外對其進行研究，是以很難找到交配的觸發因素。“有些時候我們可以弄清楚交配的誘因，并成功讓它們進行交配，但是對于很多其他物種，無論我們怎麼嘗試也找不到正确答案。” Kouba解釋道。
是以三種輔助生殖技術（ART）應運而生：（1）激素治療，該方法可以促使不情願的伴侶進行交配，或誘導卵子和精子的發育和釋放；（2）體外受精，增加後代的數量和多樣性；（3）精子或卵子冷凍技術，以備不時之需。
少數瀕危物種已經從這三種技術中受益。例如，在澳洲，激素治療将不願意配對的科羅澳拟蟾（northern corroboree frog）變成了熱情似火的戀人，這樣能確定它們都為下一代貢獻了自己的基因。來自美國拉勒米平原的懷俄明蟾蜍（Wyoming toad）在野外已滅絕，但多虧了激素和人工受精技術，它們的種群數量又開始恢複。另外，冷凍的精子也為落基山脈南部瀕臨滅絕的西部蟾蜍（Anaxyrus boreas）貢獻了一些後代。
西部蟾蜍。（圖檔來源：維基百科）
但是要完成這些工作其實并不容易。盡管近70年來科學家一直在開展一些基礎研究，來使用激素和體外受精技術培育兩栖動物胚胎，但到了20世紀90年代，當生物學家試圖借助這些技術來增加更多的兩栖動物數量時，他們發現實驗室的那套流程隻适用于特定的對象，因而無法在野外直接采用。經過數年對激素劑量的調整和測試，第一種有效的治療方法才最終确立。另外，哪怕隻是将精子和卵子融合這樣的簡單任務，也耗費了不少精力。
随着人造保護性栖息地數量的迅速增加（許多仍然無法進行自然繁殖），人們的緊迫感日益增強。“我們意識到，這項研究必須抓緊進行，”Silla表示。而現在，辛苦的工作得到了回報。她補充說：“近年來，輔助生殖技術發展得很快。”
激素療法之是以能夠刺激性腺成熟以及卵子和精子釋放，主要依靠兩種激素注射：促性腺激素釋放激素和人絨毛膜促性腺激素（一直到20世紀70年代，這些激素實驗主要為了研究人類的妊娠行為）。有些物種對第一種激素的反應最好，而另一些物種則更适合第二種，同時注射劑量和方案也至關重要。Kouba表示：“每個物種都不相同，是以要找到合适的激素并确定治療的時間和頻率可能要花費幾年的時間。”長期以來，為新物種找到合适的治療方案就是一個試錯的過程。如今，對于大約20個物種，科學家們已經确定了相應的激素療法。
随着激素治療方案數量的增加，一些規律漸漸浮出水面，而這有助于科學家們找到更多合适的激素療法。例如，兩栖動物的祖先譜系似乎決定了激素的選擇，一些蛙類和蟾蜍家族的成員對第一種激素的反應更好，而其他家族的成員則更适合第二種激素。
Silla和Byrne認為，演化因素也可能成為預測最佳精子收集時間的關鍵，因為雄性産生精子的數量及其釋放速度與物種的交配政策息息相關。
在非一夫一妻制的物種中，雄性之間的競争推動了睾丸向更大的方向演化，它們會産生更多的精子并更快地将其釋放。例如西澳洲的佐治亞索蟾（它的别名叫quacking frog，因為它會像鴨子一樣嘎嘎叫）是一妻多夫制，許多雄性成群聚集在一個産卵雌性周圍。那些雄性有巨大的睾丸，裡面充滿了數以萬計的精子。注射激素後，它們會在數分鐘内開始釋放精子。不過，Silla發現最佳的收集時間是在注射7個小時後，那時精子的釋放量會達到峰值。
與之形成鮮明對比的是澳洲南部夜宴蛙（southern corroboree frog），它是生活在新南威爾士州雪山的的極度瀕危物種。這種青蛙采取一夫一妻制，這也意味着它不需要産生很多精子，也不必對交配感到着急，是以它的睾丸很小。根據Silla和Byrne的說法，在注射激素後，他們要等待很長時間才能獲得精子。Silla說：“在這種蛙中，需要注射36個小時後才能達到精子釋放的峰值，而我們最終也隻收集到了幾百個精子。”
澳洲南部夜宴蛙。（圖檔來源：the conversation）
配子收集後，需要的第二種技術是體外受精，它能夠讓育種者控制後代的親緣關系，進而可以在小群體優化遺傳多樣性。雖然理論上聽起來很簡單，實踐中卻并不容易。傳統的方法是将卵子和切碎睾丸中獲得的精子放入培養皿中混合靜置幾分鐘，然後用水淹沒它們。溶液突然被稀釋會促使精子變得活躍。
但是在保護動物時，我們不能直接去獲得睾丸。取而代之的是，育種者必須等精子移動到洩殖腔并與尿液混合後才能收集它們。對于某些蟾蜍，隻要把它們拎起來并放到盤子上，它們就會排出精液和尿液的混合物。如果這樣做不起作用，則可以通過對腹部施加輕微的壓力。蛙類則更難獲得精子，育種者可能需要使用細導管來完成收集工作。
此外，育種想要獲得成功還取決于精子和卵子的混合比例是否正确，是否加入了激活精子的特定液體，以及其他很多原因。
第三種技術，也就是冷凍儲存技術，同樣可以提高種群數量并確定瀕危物種的遺傳基因健康。因為接受激素療法的兩栖動物通常産生精子和卵子的時間不同步，冷凍儲存技術可以先存儲一種性别的配子，直到我們獲得另一種性别的配子。
精子的長期儲存也為遺傳多樣性的優化開辟了新的可能性。一些收集好的卵子可以用許多不同雄性的精子來受精，動物園和水族館的種群可以交換精子，我們甚至可以讓野生和圈養的個體進行雜交。特别是具有抵抗疾病等有特殊價值的個體，可以在死亡後的很長時間内繼續貢獻自己的基因。
但是，正如你所想的那樣，實際操作比聽起來要複雜得多。精子的儲存要比卵子更容易，精子凍存的試驗已經在越來越多的物種身上取得了成功。Kouba和同僚一起建立了美國國家兩栖動物基因組庫，他表示：“最初精子解凍後恢複活性的機率隻有5％，現在可以達到50％至70％。我們還可以儲存活體動物體内的精子，并用它們來培育後代。”
而冷凍卵子是另一碼事：由于卵子尺寸很大，含有卵黃，水分含量高，并且還有着果凍狀厚外層，這些特征導緻科學家們至今未能成功将其冷凍。Kouba表示，這個問題必須解決。“冷凍精子确實要簡單得多，但如果隻能保留雄性基因組，而那隻是整個基因組圖譜的一半而已。”
建立更多育種項目
到目前為止，盡管需求巨大，但受益于輔助生殖技術的瀕危物種數量仍然很少。在某些育種項目中，許多或所有由此産生的後代仍被圈養，以幫助維持人工栖息地的運轉。另一些則重新回到了野外：超過30萬隻波多黎各鳳頭蟾蜍（Puerto Rican crested toadlets）已被放生到了原本的島嶼，數百隻澳洲北部夜宴蛙也回到了屬于它們的亞高山沼澤地。Silla在研究過程中培育的所有澳洲北部夜宴蛙都被放生了，對此她感到十分自豪：“我很激動，這不僅是基于實驗室的研究，而且是真實的保護行動。”
波多黎各鳳頭蟾蜍。（圖檔來源：維基百科）
在未來不久，也會出現更加先進的生殖技術，但我們無法很快将其應用于兩栖動物的育種工程中。而與此同時，數百種兩栖動物正瀕臨滅絕。Kouba表示：“現在最急切的需求之一就是建立更多的育種項目，以拯救更多的物種。”
有了運氣、耐心和其他一些要素，有些物種的數量或許能夠自行恢複。但對于其他物種來說，或許仍要寄希望于人類的幫助。“總體而言，與所有受到威脅的兩栖動物數目相比，我們所拯救的不過是九牛一毛。”Kouba說，“但是對于我們正在積極研究的那麼些蛙和蟾蜍而言，卻會産生舉足輕重的影響。”