文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
紫蘇屬唇形科紫蘇屬1a生草本植物，是一種傳統的藥食同源植物，在亞洲東部國家，特别是中國、南韓和日本廣泛種植。
其種子出油率高達46%~58%，不飽和脂肪酸含量豐富，特别是α-亞麻酸含量遠高于大豆、油菜、玉米、向日葵等油料作物。
極低的ω-6/ω-3FAs比率使紫蘇油，成為人類飲食中植物油的理想來源，此外，紫蘇油還可用于制作幹燥油漆、清漆、油墨等。
是以，紫蘇作為一種多用途經濟作物，在制藥、食品及工業等方面具有潛在的應用前景。
實驗的材料與方法
在适宜時期取紫蘇及煙草種子的，根、莖、葉、花及開花後，不同發育時期的種子，置于-80℃冰箱儲存備用，煙草置于恒溫光照培養箱中培養。
以拟南芥AtPAH1蛋白序列為檢索序列，在紫蘇基因組及轉錄組資料庫中進行BLAST同源比對，通過ORF及CDD功能結構域分析比對，篩選獲得紫蘇PAH1基因序列。
以篩選比對出的PfPAH1-1基因CDS序列為模闆，設計PCR擴增引物PfPAH1-1-ORF-F/R。
使用KOD酶進行PCR擴增，反應體系為50μL:模闆cDNA2μL，上下遊引物各1.5μL，10×PfuBuffer5μL，dNTP5μL，MgSO42μL，KOD-Plus-Neo1μL，ddH2O32μL。
反應條件為:94℃預變性2min;94℃變性15s，50℃退火30s，68℃延伸2min30s，循環35次;68℃終延伸10min。
反應結束後通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增産物，将檢測正确的産物純化回收并連接配接到pMD18-T載體上，轉化大腸杆菌DH5α感受态，挑取單克隆進行PCR鑒定篩選陽性克隆。
實驗結果分析
以拟南芥AtPAH1蛋白序列為檢索序列，通過ORF及CDD資料庫進一步分析，篩選獲得2個紫蘇PfPAH1基因序列，分别命名為PfPAH1-1和PfPAH1-2。
蛋白質功能結構域預測表明，PfPAH1-1和PfPAH1-2均含有3個保守結構域，分别為Lipin_N結構域、Lipin_mid結構域，和屬于HAD_like超家族的LNS2結構域。
基因結構分析顯示，PfPAH1-1基因含有8個内含子和9個外顯子，PfPAH1-2基因含有9個内含子和10個外顯子，與拟南芥和芝麻PAH1基因的内含子、外顯子分布相似。
紫蘇PfPAH1-1和PfPAH1-2基因編碼氨基酸數為904，編碼蛋白的分子式分别為C4375H6819N1191O1419S32。
分子品質分别為10.08ku和9.98ku，理論等電點pI分别為4.73和4.96，二者親疏水性系數均小于0，預測其為親水性水性蛋白質。
對紫蘇PfPAH1蛋白的跨膜區域及信号肽切割位點進行預測，結果表明紫蘇PfPAH1蛋白無跨膜區域，且無信号肽存在，推測其為非分泌性蛋白。
運用SOPMA軟體對PfPAH1蛋白進行二級結構預測，結果顯示：紫蘇PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白的二級結構，主要由四種元件組成。
Pf PAH1-1包含無規則卷曲56.08%，α-螺旋23.01%，直鍊延伸16.37%，β-轉角4.54%。
而Pf PAH1-2包含無規則卷曲56.75%，α-螺旋22.9%，直鍊延伸15.93%，β-轉角4.42%，推測無規則卷曲和α-螺旋為PfPAH1蛋白的主要結構元件。
通過SWISS-MODEL資料庫采用同源模組化的方法，預測紫蘇PfPAH1蛋白三級結構，選擇6tzy.2蛋白作為模闆蛋白進行同源模組化。
結果顯示:PfPAH1-1、PfPAH1-2蛋白，與模闆蛋白6tzy.2的序列覆寫度，分别為36.75%和35.05%，保守序列範圍分别為589~876aa和578~878aa。
PfPAH1蛋白與模闆蛋白均由一條多肽鍊構成，模闆蛋白含有2個CA配體，而PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白僅含有1個CA配體。
對紫蘇、拟南芥、芝麻、油橄榄、一串紅的PAH1蛋白氨基酸序列進行比對。
分析可知，紫蘇PfPAH1蛋白，存在已公布植物PAH1蛋白序列中的DXDX催化模體，該序列在這些物種中高度保守，由此推斷DXDX結構域在PAH1蛋白中發揮重要功能。
利用MEGA7.0軟體對紫蘇PfPAH1蛋白，和拟南芥、芝麻、煙草和油橄榄等植物的，PAH1蛋白建構進化樹。
紫蘇PfPAH1-1蛋白與一串紅聚為一支，同屬唇形科植物，與葡萄、芥菜等其他物種關系較遠，其進化基本符合植物進化分類，PfPAH1-2蛋白與芝麻SiPAH1親緣關系最近。
其次為油橄榄，與山嵛菜屬、辣椒等親緣關系較遠，推測紫蘇PfPAH1-2基因的功能可能與芝麻SiPAH1基因相似。
農杆菌瞬時侵染2d後，取煙草葉片提取總RNA，通過RT-PCR檢測PfPAH1-1基因是否有效表達。
結果表明，瞬時轉化後的煙草葉片中，目的基因PfPAH1-1正常轉錄形成mRNA，取瞬時侵染5d後的煙草葉片，分析紫蘇Pf PAH1-1基因瞬時表達，對煙草葉片各脂質含量的影響。
野生煙草葉片中總脂肪酸占葉片幹品質的15.29%，轉pCAM-BIA1303空載的煙草葉片中，總脂肪酸占葉片幹品質DW的15.30%。
而轉PfPAH1-1基因煙草葉片中，總脂肪酸的含量為17.35%，總脂肪酸含量顯著上升。
分析其脂質組成發現，PfPAH1-1基因瞬時表達煙草葉片中，糖脂含量沒有明顯變化，約占葉片幹品質的3.55%~3.56%，磷脂含量較WT下降0.3%，而中性脂含量提高1.86%。
實驗結果讨論
紫蘇作為一種多用途經濟作物，因其含有豐富的營養物質，及種子含油量和不飽和脂肪酸含量較高，是目前深海魚油的良好替代産品。
三酰甘油是油料作物種子油脂的主要貯存形式，PAH是TAG合成途徑中的關鍵酶。
其介導反應的底物PA是脂核苷酸CDP-DAG合成的直接前體，産物DAG是TAG合成的直接前體，這些脂質中間體的代謝失調，是導緻脂質性疾病産生的根本。
有研究表明，PAH活性依賴于鹵代酸脫鹵酶樣結構域的DXDX催化模體。
釀酒酵母PAH1DXDX(T/V)催化模體上的，天冬氨酸D398和D400兩個位點同時突變時，其活性将降低99.9%以上。
在紫蘇中鑒定獲得兩個編碼904個氨基酸殘基的PfPAH1-1和PfPAH1-2基因，均包含HAD_like結構域，同時具有PAH特有的活性位點DXDX。
且序列與拟南芥、芝麻等已公布的植物相同，表明PfPAH1-1和PfPAH1-2能夠催化其蛋白質功能，序列特征分析表明，紫蘇PfPAH1蛋白無轉運肽或跨膜區域。
分析拟南芥PAH1基因表達譜顯示，該基因在拟南芥各組織器官和不同發育階段種子中，均有表達，并在成熟期的種子中表達量達到最高。
對拟南芥PAH1的qRT-PCR分析表明，該基因在幼苗、葉、根、莖、花中都有表達，在不同發育時期種子中的表達呈先降後升的趨勢，且在成熟種子中的表達量顯著高于其他組織。
研究結果表明，PAH基因在拟南芥不同發育時期的花中均有表達。
實驗分析了紫蘇Pf PAH1基因的時空表達模式，表明PfPAH1-1在紫蘇各組織中均有表達，随着種子的成熟，Pf PAH1-1表達量先下降後升高。
在種子發育前期表達量最低，随後逐漸升高，成熟種子中表達量顯著高于其他時期；PfPAH1-2基因在紫蘇不同組織中，表達量均較低。
推測，在紫蘇脂質合成代謝調控過程中，Pf PAH1-1起主導作用，且在發育中期種子中，可能更多參與以PA為底物合成PI及PG的反應，而後在TAG及磷脂合成過程中同時發揮作用。
PAH将PA轉化，為DAG以提供磷脂和TAG生物合成的底物，是甘油酯組裝的重要步驟。
在釀酒酵母的研究中，pah1Δ突變體中磷脂生物合成相關基因表達上調，磷脂水準增加，但DAG、TAG水準明顯下降。
相反，PAH1的過表達會導緻磷脂生物合成基因表達被抑制，磷脂生物合成受到損害，但可有效加強釀酒酵母細胞内的油脂合成。
在植物中，拟南芥Δpah1pah2雙突變體中含有的磷脂是野生型的2倍，編碼磷脂合成的幾種關鍵酶基因均被上調，且總脂肪酸含量降低15%。
為進一步分析紫蘇PfPAH1-1基因的功能，本研究通過農杆菌侵染法将目的基因在煙草葉片中瞬時表達，測定瞬時表達後煙草葉片中各脂質組分的含量。
結果表明，轉PfPAH1-1基因煙草葉片中的總脂肪酸含量顯著升高，其脂質組成也有所變化，其中中性脂水準提高，磷脂含量降低，而糖脂含量基本不變。
由此推測，紫蘇PfPAH1-1基因瞬時表達，有效加強了TAG合成途徑中磷脂PA向DAG的轉變，中性脂水準升高。
而該基因過表達可消耗磷脂合成底物PA，使得磷脂合成過程受阻，降低磷脂含量，結合前人研究結果，這一現象也可能與磷脂合成酶基因表達降低有關。
在植物的長期進化過程中，改變膜脂組分是植物适應逆境脅迫的重要途徑。
其中，甘油酯是膜脂質的主要成分，膜甘油脂由附着在sn-1和sn-2位置的兩種疏水性脂肪酸，及甘油主鍊sn-3位置上的磷或糖分子組成。
Pf PAH1-1基因在煙草葉片的瞬時表達，可引起煙草葉片中膜脂組分的變化，是以推測其在響應植物逆境脅迫中，可能具有一定調控作用。
以拟南芥AtPAH1蛋白序列為參考序列，鑒定得到2個紫蘇PfPAH1基因，分别命名為Pf PAH1-1和PfPAH1-2，對其序列特征和表達特性進行分析。
通過RT-PCR技術，成功獲得組織中高表達紫蘇PfPAH1-1基因的cDNA克隆，并初步探讨了該基因，在煙草中異源表達對煙草脂質組成的影響。
為深入研究PfPAH1-1基因，在植物油脂合成積累中的分子機制奠定理論基礎，同時為通過基因工程手段，改變紫蘇及其他油料作物的脂質組分，提供有益基因元件。