文 |江煙染
編輯 | 江煙染
前言
大西洋鲑魚是一種重要的經濟魚類，也是自然界中免疫病毒感染研究的模式物種之一。
然而，鲑魚養殖業面臨着高溫和中度缺氧等環境壓力的挑戰，這是因為先天免疫反應作為一種重要的防禦機制，對于鲑魚在應對這些壓力方面扮演着關鍵角色。
過去的研究表明，高溫和缺氧對鲑魚的免疫系統産生了不可忽視的影響。
在高溫環境下，鲑魚的免疫系統會發生結構和功能的改變，導緻其對病原微生物的抵抗力下降。
而在缺氧條件下，鲑魚的免疫細胞活性和免疫相關基因表達也會受到明顯影響。
就是有一些相關的研究，但是關于大西洋鲑魚先天免疫反應在高溫和中度缺氧環境中的表現的資料，目前還比較少。
接下來，小染将為大家講解，高溫和中度缺氧對于鲑魚來講真的是不可逆的嗎？
溫度上升——鲑魚的災難
很多的國家在2014~2019年間都釋出了氣候、溫度上的報告，報告表示全球變暖将會成為現實，而世界海洋表面溫度還會上升3-80°C。
是以，了解高溫如何影響海洋物種至關重要，而這個問題在全球範圍内也是越來越人們的廣泛關注。
此外，随着缺氧事件的頻率和嚴重程度的增加，研究海洋生物相關的專家預計，水溶氧含量（缺氧）的降低，将影響海洋生物的健康和分布。
其中，飼養海洋魚類的海水養殖場，最容易受到這些環境條件變化的影響，因為它們通常位于沿海地區，如果魚類受到限制，那麼養殖場的人基本上無法尋找更有利的、适合魚類生長的條件。
例如，塔斯馬尼亞的大西洋鲑魚海籠的溫度，在2020年就超過了22-23°C，要知道加拿大和挪威夏季的水溫通常達到18-20°C，而氧氣水準在這些時期降至空氣飽和度的12%以下，這樣的情況并不少見。
這是因為環境條件的這些變化，對水産養殖業來說是一個相當大的挑戰，畢竟它們會影響海網箱中魚類的生長、健康和福利。
站在魚類健康層次來講很顯著的就是起伏的水溫，可以調節魚類的免疫功能，是以在很大的程度上正常運作的免疫系統，是魚類抵抗細菌和病毒感染能力的關鍵。
基于這個觀點，相關人員觀察了一些魚，發現它們似乎更多地依賴于低溫的非特異性反應，但在較高的溫度下，它們可能更多地依賴于特異性免疫力。
是以，這些人依然沒能明白，高溫是否會損害魚類對感染的反應能力，特别是在大西洋鲑魚等養殖魚類在夏季可能實際面臨的熱條件，即溫度升高到接近或超過其緻死的上限。
要知道魚類死亡的其中一個原因就是缺氧，而缺氧與疾病暴發有着很大的關系，并且已知會對魚類免疫功能産生不利影響。
相關的報告說急性缺氧降低了大西洋鲑魚腎髒中ifna和mx的組成轉錄物水準。
而慢性和中度間歇性缺氧，還會減少該物種的白細胞呼吸爆發，有相關人員對此進行了測試，他們先将小鲑魚暴露于慢性缺氧中，然後對其進行病毒或細菌的免疫刺激，最後發現雖然缺氧減少或延遲了免疫相關基因的表達，但總體影響并不大。
在這之後，這些人想要檢視關于中毒缺氧和高溫的組合，對魚類免疫反應的影響的資料，于是想要先檢視關于中度缺氧結合高達20°C的溫度增量升高，對大西洋鲑魚免疫功能的影響。
而找這兩種相關的資料，是因為塔斯馬尼亞州似乎普遍存在這種情況，這在2019年夏季紐芬蘭鲑魚網箱養殖場的大規模死亡可以看出。
然而，這兩種資料都沒有找到，也就是說，這一類的實驗并未有人做出努力，發現這一點後，這些人就對此進行了實驗。
小可伶——鲑魚
實驗的開始是從挑選研究對象開始的，因而聖約翰河品種的大西洋鲑魚成了最佳的選擇，畢竟聖約翰河與塔斯馬尼亞溫度基本相同。
但是在抓捕這些大西洋鲑魚之後，并不能直接實驗，需要先在3000升的圓形水箱中儲存一個月，這是為了讓鲑魚适應。
在此期間，海水溫度和氧氣水準分别為10±1°C和>95%的空氣飽和度，而光周期為12h，并且每天以1%體重的日糧飼喂食。
一個月之後，這些鲑魚就會被馴化，然後就進行下一個步驟，在含有三卡因甲烷磺酸鹽的海水中，将鲑魚輕度麻醉，進行稱重，這樣是為了更加的準确。
在稱重結束後，還要将一個PIT(被動內建應答器)标簽植入其腹膜腔以進行個體識别，再将這些魚放回相同的水箱中大約1個月的時間。
在此期間之後，将重複罐分為三種處理：對照（CN），溫氧和常氧（WN）以及溫缺氧（WH）。
将其中一個集管罐指定為控制罐供電，另一個集管罐為WN和WH罐供電。
對于對照處理，在整個實驗過程中，溫度和氧氣水準分别保持恒定，但WH處理，會在2周的時間内，通過減少為這些罐提供氧氣集管罐中的氧合作用，并将儲罐中的氧氣水準逐漸降低到70%（空氣飽和度）。
而WN進行中的氧氣水準，通過在儲罐中放置氧氣擴散器，将氧氣水準保持在100-110%氧氣水準。
此後，WN和WH罐内溫度從12℃逐漸升高至20℃，其中每周溫度增量為0.3°C，而第4天為0.1°C，第5-7天則是無變化。
當WN和WH缺氧罐的水溫達到20°C時，魚再适應這些條件4周，而且每天兩次(9:00和15:00)用商業鲑魚飼料，小心地用手喂食鲑魚直至飽腹，也就是說當看見幾個顆粒開始積聚在每個水箱底部時，停止喂食。
在所需溫度下，缺氧罐以15L分鐘的速度供應海水(流通系統)，再通過大型闆式換熱器控制海水溫度，該換熱器将加熱的海水輸送到真空除氣器，而真空除氣器供應每個集水箱，并且每天早上監測所有實驗水箱的水箱溫度和溶解氧水準。
此外，帶有預校準浸漬探頭和一台運作軟體（PreSens）的計算機，用于連續監測其中一個缺氧罐中的溶解氧水準。
還每周監測其中一個缺氧罐中的氨和亞硝酸鹽，并保持在可接受的水準。
這樣使魚适應四周之後，對初始鲑魚抽樣，剩下的魚麻醉在海水中，然後在鲑魚眼睛後面的軟骨中，注入熒光彈性體ForteVII（紅色）和PBS（黃色）。
這是因為，熒光彈性體可以快速識别水箱中的鲑魚，并且由于這種組織血管化不良，是以最大程度選擇減少有發炎的鲑魚。
在注射後的6、12、24和48小時（HPI）對他們的脾髒和頭部腎髒進行采樣。
在24HPI時，還通過尾部穿刺收集血液，以測量呼吸爆發，補體系統替代途徑的溶血活性和血漿溶菌酶濃度，并稱量脾髒以計算脾體指數。
最後，測量了12個基因的頭腎轉錄表達水準，在所有時間點參與所有組中鲑魚的抗菌或抗病毒中的反應。
實時定量聚合酶鍊反應（qPCR）分析中使用的引物
這樣的測量資料相當于這一部分已經結束了，接下來是最關鍵的部分了，那就是給不同缺氧程度水準下的魚注射白細胞，這樣可以有效的觀察，鲑魚在不同的缺氧程度下，所能承受的高溫變化。
鲑魚的體液免疫反應
體液免疫反應首先需要通過化學發光測量鲑魚血白細胞，産生活性氧（ROS）。
簡而言之，就是需要将全血加入到魯米諾，然後在0.2M硼酸鈉和PBS中的混合物中，将該溶液的225μL加入到96孔白色斜闆中。
之後再使用酶标儀在室溫（~5°C）期間，獲得了每秒發光計數（LCS）的曲線，并取峰值來表示每個樣品的呼吸爆發。
在24HPI下，在常氧或缺氧下保持在20°C的PBS注射魚的白細胞比CN（6°C）魚的呼吸爆發明顯更高（14倍和12倍）。
此外在ForteVII注射後WH魚的白細胞比WN魚的呼吸爆發明顯更高。
在CN魚中注射ForteVII導緻呼吸爆發減少61%，這種影響在WN和WH魚中也很明顯，在注射VII後，其值分别降低了53%和69%。
是以，補體系統的溶血活性或血漿溶菌酶濃度，在治療組或注射組之間沒有顯着差異。
但與其他處理相比，WH魚的SSI降低了2%，雖然ForteVII注射不影響CN和WN魚的SSI，但它将WH進行中的SSI增加到CN和WN進行中測量的水準。
然而，注射PBS的CN魚在24和48HPI時，具有顯着更高的camp-b轉錄表達水準，因為ifng水準在6HPI時顯着低于其各自的基線值。
相比之下，VII注射顯着影響10個基因中12個的轉錄本表達水準，而注射VII 後，包括il7b、il1-a、stlr2-a 和 ifng 在内的5個基因的水準大幅上調，而IRF7-B和Stat1-B的水準分别僅增加了2倍和2.6倍。
有趣的是在注射V II的CN魚中，與PBS組VII刺激基因之間峰表達的時間也不同。
而cox2的轉錄表達水準最高，其中12 HPIcamp-b和stat1-b的轉錄表達水準最高，在48HPI時達到峰值。
由此可以看出，預計氣候變化将提高水溫、降低海洋環境中的氧氣含量，這可能影響魚類的健康和福利，包括它們對病原體作出反應的能力。
然而，大西洋鲑魚在常氧或中度缺氧下承受水溫的受控增量升高，然後在20°C下保持4周。
這些條件（即與中度缺氧相關的溫度升高）實際上反映了養殖鲑魚在夏季可能面臨的情況。
雖然操縱這些環境條件，不影響補體系統的活性或血漿溶菌酶濃度，但高溫（20°C）顯着增加呼吸爆發，并且這種挑戰與中度缺氧的組合進一步增加了這種反應。
此外，高溫上調了頭部腎髒中il1bil8-acox2、hamp-astlr5-a和irf7-b轉錄本的組成表達，并加速了Forte V II刺激後cox2，hamp-a，camp-b和stat1-b轉錄本表達水準的增加。
有趣的是盡管高溫影響了轉錄本表達水準變化的時間，但它對這些變化的幅度沒有重大影響，缺氧幾乎沒有額外的影響。
研究結果表明，中度缺氧與高達20°C的溫度增量升高相結合，不會損害大西洋鲑魚先天免疫系統對細菌病原體的反應能力。
結語
由于加速的氣候變化，魚類可能會面臨接近或超過其熱上限的升高溫度，并且經常與缺氧相結合。
然而，人們對氣溫上升和溶解氧水準降低對魚類免疫防禦的影響知之甚少。
在研究中，發現水溫單獨增加到20°C或結合中度缺氧（70%空氣飽和度），對大西洋鲑魚産生先天免疫反應的能力的影響非常有限。
這些發現并不支援鲑魚先天免疫反應在高溫和缺氧下受到極大損害的假設，是以表明這種影響不是夏季疾病爆發的原因。
然而檢查的條件，即20°C和中度缺氧，也很可能處于該菌株鲑魚生理耐受性的邊緣或極限，并且這些環境條件的進一步惡化可能導緻鲑魚免疫功能的損害。
其實高溫條件下鲑魚的免疫系統受到抑制，免疫細胞活性降低，導緻其對病原微生物抵抗力下降。
這表明在全球氣候變暖的背景下，鲑魚養殖業面臨着巨大的挑戰，需要采取措施來應對高溫對免疫系統的不利影響。
而且在中度缺氧條件下，大西洋鲑魚的免疫反應也受到明顯影響，因為缺氧環境，會導緻免疫細胞的功能和代謝異常，進而降低鲑魚對病原微生物的免疫能力。
這提醒我們，在鲑魚養殖過程中，必須重視水質管理和缺氧風險的控制，以減少缺氧對免疫系統的不利影響。
然而，盡管高溫和中度缺氧對大西洋鲑魚的先天免疫反應産生了負面影響，但鲑魚仍表現出了一定的适應能力。
之前的一些研究表明，在一定程度的高溫和缺氧條件下，鲑魚免疫系統能夠通過适應性調節來保持一定的免疫功能，進而提高對病原微生物的抵抗能力。
這反映出鲑魚在進化過程中對複雜環境的适應性，并為鲑魚養殖業提供了希望。
是以，可以得出一些啟示，加強水質管理和控制溫度是至關重要的，特别是在面臨高溫和缺氧風險時，提供适宜的水質條件和維持适宜的溫度範圍，可以幫助鲑魚免疫系統的正常功能，提高其抵抗病原微生物的能力。
在鲑魚養殖業的發展過程中，應注重可持續發展和環境保護，以確定鲑魚産業的可持續性，并在保護環境的前提下滿足人們對鲑魚産品的需求。
總之大西洋鲑魚先天免疫反應在高溫和中度缺氧環境下受到負面影響，但鲑魚仍具有一定的适應能力。
是以，面對加速的氣候變化，我們對魚類免疫功能以及如何保護具有重要商業意義的水産養殖物種免受病原體侵害還有很多東西要了解。