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慕蒼顔
慕蒼顔
前言
釀酒酵母是一種用途廣泛的生産生物燃料、化學品和藥物的微生物細胞工乙酰輔酶 A (acetyl-CoA) 和丙二酰輔酶 A (malonyl-CoA) 是酵母中重要的中心代謝産物，參與許多細胞過程，如磷脂合成和細胞調節。
它們還充當各種産品的前體分子，包括類異戊二烯、聚酮化合物、類黃酮和平台化學品，這些化學品可用作生物燃料，化妝品、藥品、營養成分，大宗化學品等，是以，提高細胞内乙酰輔酶 A 和丙二酰輔酶 A 的水準對于提高一系列高附加值化合物的産量至關重要。
什麼是乙酰輔酶 A 衍生化學物質
乙酰輔酶 A 衍生化學物質（acetyl-CoA derivatives）是一類重要的有機化合物，從乙酰輔酶 A （acetyl-CoA）中衍生而來，乙酰輔酶 A 是生物體内最常見的代謝底物之一，同時也是許多生物工藝合成的重要中間産物。
乙酰輔酶 A 是一種極易反應的小分子，它可以與一些代謝途徑中的其他底物結合，形成多種不同的乙酰輔酶 A 衍生化學物質，如乙酰輔酶 A 檸檬酸、乙酰輔酶 A 乳酸、乙酰輔酶 A 丙酮酸等。
乙酰輔酶 A的應用
由于乙酰輔酶 A 衍生化學物質具有廣泛的生物學活性和生物化學反應通路，是以在現代生物技術和化學合成領域廣泛應用，比如在食品、飲料、化妝品工業中，乙酰輔酶 A 衍生化學物質可以被用作增香、增酸、保濕、抑菌等劑型的添加劑；在藥物和抗惡性良性腫瘤藥物研發中，乙酰輔酶 A 衍生化學物質可以被作為活性成分和中間體等方面得到應用。
在乙酰輔酶 A 衍生化學物質的制備過程中，動态調整酵母儲存碳水化合物是一種行之有效的方式，這是因為酵母在分裂生長的過程中需要用到完備的代謝途徑，途徑中需要消耗大量的碳水化合物和其他物質，當然，碳水化合物的不合理調整會導緻乙酰輔酶 A 衍生化學物質的數量下降，甚至還會影響其他生物過程的進行。
乙酰輔酶 A的重要突破
通過動态調整酵母儲存碳水化合物，可以使酵母在對碳水化合物的利用和存儲過程中，盡量維持它們所需的代謝途徑的完整性，進而有效地提高乙酰輔酶 A 衍生化學物質的産量，此外，該方法還可以應用于其他化學物質的生産中，是生物制造領域的一個重要突破。
在實際應用中，動态調整酵母儲存碳水化合物該如何控制
在實際應用中，動态調整酵母儲存碳水化合物是一種非常有效的方法來提高乙酰輔酶 A 衍生化學物質的産量，但是，如何控制酵母儲存碳水化合物是一個需要解決的問題，下面将對該問題進行探讨。
一般來說，酵母儲存碳水化合物的過程受到外部環境的影響，其中最顯著的因素是碳水化合物的營養來源和碳水化合物的數量，在實際應用中，可以采取以下措施來控制酵母儲存碳水化合物，進而達到動态調整酵母儲存碳水化合物的目的。
過度表達UGP1、GDB1和LAT1基因可改善丙二酰輔酶 A 通量
我們之前提到過，使用體内誘變結合生物傳感器介導的基于生長的篩選系統篩選了四種具有改進的丙二酰輔酶 A 通量的突變菌株，通過全基因組測序鑒定了具有單核苷酸多态性和插入-缺失 的常見變化基因，在這裡，我們在對照菌株中用 SNP 過表達常見變化的基因。
然後通過在這些菌株中表達丙二酰輔酶 A 還原酶 (MCR) 來确定丙二酰輔酶 A 下遊化學物質 3-HP 的産生，有趣的是，我們發現UGP1、LAT1和GDB1的突變版本的過表達使 3-HP 産量增加了 40%–50%，為了确定突變或表達水準是否導緻産量增加，原始的UGP1、LAT1和GDB1基因被過表達并且 3-HP 産量也增加了。
Ugp1動态調節不同生長階段儲存碳水化合物和糖酵解之間的碳配置設定
Ugp1 是一種 UGP 酶，可催化 UDP-葡萄糖的可逆形成，UDP-葡萄糖在多種細胞過程中用作糖基供體，包括糖原和海藻糖的合成，β-葡聚糖，糖脂和糖蛋白，和半乳糖進入糖酵解。
相反， UGP1過表達菌株的 3-HP 産量在早期指數期低于對照菌株，但在後期較高，為了實時監測丙二酰輔酶 A 随平，我們在UGP1過表達菌株和對照菌株中引入了丙二酰輔酶 A 生物傳感器，我們之前已經證明，丙二酰輔酶 A 水準與 GFP 的表達呈正相關。
菌株的丙二酰輔酶
與 3-HP 生産一緻， UGP1過表達菌株的丙二酰輔酶 A 水準在早期指數期也較低，但在後期逐漸增加，這意味着UGP1的過表達導緻後期的丙二酰輔酶 A 水準高于對照菌株。
當葡萄糖過量時，碳流向糖原儲存碳，當葡萄糖水準低時，儲存的碳水化合物被消耗，是以更多的碳可以用于合成丙二酰輔酶A。
UGP1過表達改善乙酰輔酶 A 衍生的化學物質
丙二酰輔酶 A 由乙酰輔酶 A 合成，乙酰輔酶 A 是在釀酒酵母中丙酮酸脫羧生成乙醇和乙酸産生的，然後乙酰輔酶 A 合成酶 (ACS) 催化乙酸生成乙酰輔酶 A，為了确定UGP1過表達是否也會影響固有的酵母代謝物和乙酰輔酶 A 代謝。
然後通過表達 MCR 或 α-法呢烯合酶來測量 3-HP（丙二酰輔酶 A 衍生的化學物質）和 α-法尼烯的産量，UGP1過表達菌株的3-HP産量在早期較低，但在後期逐漸增加，
驗證UGP1過表達是否可以與影響乙酰輔酶 A 可用性
為了驗證UGP1過表達是否可以與影響乙酰輔酶 A 可用性的其他偶然基因結合以進一步增加化學産量，我們将 UGP1 過表達與我們通過 3-HP 生産鑒定和确定的其他基因結合（p < 0.01 )，我們發現不同基因靶點的組合可以進一步提高 3-HP 的産量。
例如，與UGP1單基因過表達相比， SDH3的引入和ARG3的缺失進一步增加 3-HP 産量 50%，是以，我們确定的目标可以與其他方法相結合，以提高乙酰輔酶 A 和丙二酰輔酶 A 衍生化學品的産量
研究的局限性
不難發現通過UGP1表達增加儲存的碳水化合物可以改善對丙二酰輔酶 A 和乙酰輔酶 A 衍生化學物質的代謝通量，此外，我們證明了 Ugp1 在不同生長階段動态調節儲存碳水化合物和糖酵解之間的碳配置設定，但是，我們不能排除它間接影響其他代謝途徑的可能性，未來将測量代謝通量分布。
菌株和生長培養基
其中使用的酵母菌株源自釀酒酵母CEN.PK 2-1C，應用了酵母培養、基因破壞和轉化的标準方法。
媒體和文化條件
大腸杆菌菌株 DH5α 用于重組 DNA 操作，并在 Luria-Bertani 肉湯中于 37°C 在搖瓶中培養200 rpm 的搖動速度，LB 補充有 100 mg/L 氨苄青黴素用于質粒維持和繁殖。
根據細胞的營養缺陷型，酵母菌株在 30°C 下在 YPD 培養基或合成完全脫落培養基中生長，YPD培養基含有10 g/L酵母提取物和20 g/L蛋白胨，輔以20 g/L葡萄糖，用于培養不含任何質粒的酵母細胞。
菌株和質粒建構
還使用了和建構的所有菌株和質粒分别呈現在我們眼前，通過限制酶消化和連接配接或吉布森組裝建構質粒，釀酒酵母 CEN.PK 2-1C用作所有實驗的背景菌株，為了建構過表達質粒，通過相應的引物對從CEN.PK 2-1C或突變株的基因組中擴增基因片段，DNA 片段用限制酶消化并連接配接到表達載體 pJFE3 中，為了建構不同表達水準的UGP1 。
它在PGK1p、TEF1p和CYC1p的控制下建構，并克隆到多拷貝質粒 pJFE3 中，為了建構覆寫表達質粒，将BI O 2、LAT1或SDH3與TEF1啟動子和TEF1終止子進入 pJFE3 質粒，産生 pJ-BIO2、pJ-LAT1、pJ-SDH3；UGP1與PGK1啟動子和CYC1終止子組裝到 pJ-BIO2、pJ-LAT1 或 pJ-SDH3 質粒中。
糖原和海藻糖測定
酵母培養物在不同時間生長和收獲，收獲大約 100 OD 600的培養物并用無菌 H 2 O 洗滌兩次，收集沉澱物并冷凍在液氮中，将沉澱重新懸浮在 500 μL 的 0.25 M Na 2 CO 3中并在 95°C 下孵育 4 小時，然後向樣品中加入 0.15 mL1M乙酸和0.65 mL 0.2 M 乙酸鈉，在 57 °C 下，糖原被 70 U/mg 澱粉葡萄糖苷酶消化過夜。
海藻糖被 0.05 U/mL 海藻糖酶在 37 °C 持續搖動下消化過夜，消化後，收集上清液并使用葡萄糖比色/熒光測定試劑盒測量源自糖原或海藻糖的葡萄糖濃度。
熒光強度測量
使用多檢測酶标儀測量熒光強度，在 600 nm 處測量細胞密度，GFP 的激發和發射波長分别為 485 ± 20 和 585 ± 20 nm，為了測量UGP1過表達菌株和對照菌株的熒光，收集過夜培養物，接種到初始 OD 600 為 0.2 的新鮮 SC 培養基中，培養 48 小時。
代謝物分析
菌株在裝有 5 mL SC 培養基的試管中進行預培養，将種子培養物接種到搖瓶中，工作體積為 40 mL，初始 OD 600為 0.2，持續 48 小時，為了提取 α-法尼烯，将 10%十二烷添加到媒體中，通過配備 Aminex HPX-87H 柱，的 HPLC測量 3-HP 和葡萄糖的濃度。
對于葡萄糖、乙醇和乙酸的分析，HPLC 系統在 45°C 下以 5 mM H 2 SO 4作為流動相以 0.6 mL/min 的流速運作；用于分析 3-HP、H 2 SO 4(2.5 mM) 為流動相，流速為 0.6 mL/min，柱溫為 65°C，使用配備 Rtx-5 毛細管柱和火焰離子化檢測器，進樣器和檢測器的溫度分别設定為 280 和 290°C。
結論與觀點
由于受到代謝網絡的高度調控，提高酵母中關鍵代謝物的可用性仍然是一項具有挑戰性的工作，在某些情況下，多個目标基因的共過表達顯示出拮抗作用，我們發現将UGP1與其他標明的基因靶點結合可以進一步提高 3-HP 的産量，我們相信，在我們的研究中發現的新緻病基因将有助于合成範圍廣泛的乙酰輔酶 A 衍生化合物。
參考文獻
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