免疫治療已成為繼手術、化療和放療之後的第四種惡性良性腫瘤治療方法。有别于直接靶向惡性良性腫瘤細胞的正常治療方法，免疫治療通過調節和激活人體免疫系統，依靠自身免疫機能來殺滅惡性良性腫瘤細胞。其中，以抗CTLA-4和PD-1單抗為代表的免疫檢查點抑制療法，通過解除惡性良性腫瘤免疫耐受、增強CD8+T細胞功能進而清除惡性良性腫瘤細胞，成為目前惡性良性腫瘤治療的熱點[1]。
近年來，研究人員們又發現微生物及其代謝産物，對人體健康，尤其是惡性良性腫瘤治療，有着超乎想象的影響。越來越多的研究表明，腸道微生物群能調節免疫治療的療效[2]。
近日，日本順天堂大學竹田和由教授領銜的研究團隊，發現德氏乳杆菌保加利亞亞種OLL1073R-1，也就是酸奶裡常見的保加利亞乳杆菌，能分泌胞外多糖，通過Gro3P基團結合CD8+T細胞表面的LPA受體，誘導CCR6表達，對表達CCL20的惡性良性腫瘤，增強免疫檢查點抑制劑的抗癌效果。研究結果[3]發表在國際頂級醫學期刊Cancer Discovery上。
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CD8+T細胞是惡性良性腫瘤免疫的主要效應細胞，與惡性良性腫瘤細胞直接接觸，産生穿孔素和γ幹擾素等效應分子，凋亡和清除惡性良性腫瘤細胞。是以，促進CD8+T細胞進入惡性良性腫瘤組織，是實作惡性良性腫瘤免疫治療的關鍵[4]。
而T細胞的遷移和浸潤，則通過其細胞表面的趨化因子受體結合趨化因子進行介導。腸道内的微生物，能通過代謝産物，招募T細胞從腸道遷移到惡性良性腫瘤，增強抗惡性良性腫瘤的免疫反應[5]。
保加利亞乳杆菌是酸奶發酵所必需的一種益生菌。既往有研究發現，保加利亞乳杆菌能降低普通感冒和流感的感染風險[6]，還能通過産生胞外多糖，增強小鼠的NK細胞活性并誘導脾細胞産生γ幹擾素[7]。
那麼，保加利亞乳杆菌是否也能趨化T細胞，進而影響惡性良性腫瘤的免疫治療呢？
首先，研究人員擷取保加利亞乳杆菌分泌的胞外多糖，口服飼喂正常小鼠後，檢測小鼠腸道集合淋巴結中T細胞趨化因子受體的表達情況。結果發現在CD8+T細胞中，趨化因子受體CCR6的表達水準顯著上調。在體外，研究人員也觀察到了同樣的實驗結果：用保加利亞乳杆菌胞外多糖刺激脾髒或外周血來源的細胞，CCR6也特異性地在CD8+T細胞中高表達。保加利亞乳杆菌的胞外多糖，能誘導CD8+T細胞表達趨化因子受體CCR6。
随後，研究人員分析了CCR6表達水準與惡性良性腫瘤預後之間的關系，發現在結直腸癌等患者中，CCR6的高表達與總生存期的延長顯著相關。由于趨化因子受體CCR6隻有唯一一種配體，趨化因子CCL20，研究人員也檢測了CCL20在惡性良性腫瘤中的表達情況，發現在結直腸癌組織中，CCL20的表達顯著升高。這些結果表明，表達CCR6的CD8+T細胞浸潤至表達CCL20的惡性良性腫瘤，可能提示預後良好。
小鼠口服保加利亞乳杆菌胞外多糖（EPS-R1）後，圖A：腸道集合淋巴結（PP）内CD8+T細胞的趨化因子受體CCR6的表達水準顯著上調；圖B：流式細胞儀分析證明CD8+T細胞中CCR6表達上調；圖C：生存分析顯示CCR6的高表達與結直腸癌（CRAD）等癌症的總生存期的延長顯著相關；圖D和E：體外用胞外多糖刺激脾細胞時，CCR6的表達比例在CD8+T細胞中明顯地選擇性增加。
為了驗證惡性良性腫瘤組織中CCR6+CD8+T細胞和CCL20之間的關系，研究人員進行了動物實驗。
鑒于CCL20在結直腸癌中高表達，在黑色素瘤中低表達，研究人員分别建構了結直腸癌和黑色素瘤小鼠，作為CCL20不同表達水準的惡性良性腫瘤模型。口服胞外多糖處理惡性良性腫瘤小鼠，在結直腸癌組織中，CD8+T細胞表達CCR6的比例随處理時間的延長而升高。這表明，胞外多糖誘導的CCR6+CD8+T細胞，能選擇性地浸潤至表達CCL20的惡性良性腫瘤組織。
接下來，研究人員探究了胞外多糖對免疫檢查點抑制療法的影響，使用胞外多糖分别處理結直腸癌或黑色素瘤小鼠，同時給予免疫檢查點抑制劑治療。結果高表達CCL20的結直腸瘤體顯著縮小，而低表達CCL20的黑色素瘤瘤體無變化；結直腸癌經抗體中和CCL20後，再予胞外多糖和免疫檢查點抑制劑治療，則瘤體不再縮小；而将黑色素瘤過表達CCL20後，再予胞外多糖和免疫檢查點抑制劑處理，則瘤體顯著縮小。這些結果表明，胞外多糖依賴CCL20，增強免疫檢查點抑制劑的抗惡性良性腫瘤作用。
使用胞外多糖分别處理結直腸癌(Colon26)或黑色素瘤(B16F10)小鼠，同時給予免疫檢查點抑制劑(aCTLA-4 mAb,aPD-1 mAb)治療。圖G:高表達CCL20的結直腸癌瘤體顯著縮小，圖H:低表達CCL20的黑色素瘤瘤體無變化，圖I将:黑色素瘤過表達CCL20後，則瘤體顯著縮小，圖J:結直腸癌經抗體中和CCL20後，則瘤體不再縮小。
然而，保加利亞乳杆菌的胞外多糖，又是如何增強免疫檢查點抑制劑的抗惡性良性腫瘤效應？
在體外，胞外多糖處理惡性良性腫瘤細胞，既不誘導細胞死亡也不抑制細胞增殖，表明胞外多糖并非直接作用于惡性良性腫瘤細胞來增強抗惡性良性腫瘤免疫反應。
在惡性良性腫瘤微環境中，CD8+T細胞可産生γ幹擾素等細胞因子提高對惡性良性腫瘤細胞的殺傷能力。于是，研究人員敲除了γ幹擾素基因，觀察胞外多糖對惡性良性腫瘤的影響。
敲除結直腸癌小鼠的γ幹擾素基因後，飼喂胞外多糖，則不再對免疫檢查點抑制劑産生抗惡性良性腫瘤增強作用。
轉錄組測序也發現，胞外多糖處理免疫檢查點抑制劑治療的結直腸癌，γ幹擾素以及CXCR3等幹擾素生成相關基因的轉錄水準也上調。
這些結果表明，胞外多糖誘導的CCR6+CD8+T細胞，對免疫檢查點抑制劑抗惡性良性腫瘤的增強效應，是通過γ幹擾素介導的。
圖A：γ幹擾素的體外敲除不影響胞外多糖誘導産生CCR6+CD8+T細胞，圖B：γ幹擾素的體内敲除使得胞外多糖喪失了對免疫檢查點抑制劑的抗惡性良性腫瘤增強作用，圖C：胞外多糖聯合免疫檢查點抑制劑治療結直腸癌，γ幹擾素以及CXCR3等幹擾素生成相關基因的轉錄水準上調。
保加利亞乳杆菌的胞外多糖中存在基團3-磷酸甘油(Gro3P)，既往有研究發現Gro3P具有免疫調節活性。據此，研究人員推測，Gro3P是胞外多糖發揮抗惡性良性腫瘤增強效應的功能基團。
研究人員把去除了Gro3P的胞外多糖口服飼喂小鼠，發現小鼠腸道集合淋巴結内CD8+T細胞中，CCR6+群體沒有增加，而且也喪失對免疫檢查點抑制劑抗惡性良性腫瘤的增強作用。這證明了Gro3P是胞外多糖增強免疫檢查點抑制劑抗惡性良性腫瘤效應的關鍵。
Gro3P能結合溶血磷脂酸（LPA）受體，而CD8+T細胞表達LPA受體。是以，研究人員再次推測，CD8+T細胞的LPA受體介導了胞外多糖對CCR6表達的誘導。
研究人員進行了體外實驗，首先使用LPA受體激動劑RP-1處理CD8+T細胞，發現CCR6表達上調，而敲除CD8+T細胞的LPA受體，則胞外多糖不能上調CCR6的表達。這證明了LPA受體是CD8+T細胞表達CCR6的必要條件。
圖C：胞外多糖和LPA都存在Gro3P基團，圖E：質譜檢測胞外多糖存在Gro3P基團，圖I：LPA受體激動劑RP-1能上調CD8+T細胞表達CCR6,圖J：敲除CD8+T細胞的LPA受體（Lpar2）,胞外多糖不能上調CCR6的表達。
綜上所述，保加利亞乳杆菌依靠胞外多糖的Gro3P基團，與CD8+T細胞表面的LPA受體結合，誘導趨化因子受體CCR6表達，促進CCR6+CD8+T細胞浸潤至表達趨化因子CCL20的惡性良性腫瘤，産生γ幹擾素，維持T細胞功能，增強免疫檢查點抑制劑的抗癌效果。
既往有研究發現，酸奶的攝入與結直腸癌的風險降低有關[9]。現在，竹田教授團隊發現，酸奶發酵所用的保加利亞乳杆菌能分泌胞外多糖，增強免疫檢查點抑制劑的抗癌效果。但是，本研究的結果和結論隻是基于實驗動物鼠。然而，與齧齒動物相比，人類的基因更多樣化，接觸的微生物也更多樣化，在人類中，微生物群和宿主之間的交叉對話要比小鼠的複雜得多，是以，對于“酸奶抗癌”，還需審慎看待和進一步的驗證。
參考文獻：
[1] Brunner-Weinzierl MC, Rudd CE. CTLA-4 and PD-1 Control of T-Cell Motility and Migration: Implications for Tumor Immunotherapy. Front Immunol. 2018;9:2737. Published 2018 Nov 27. doi:10.3389/fimmu.2018.02737
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責任編輯丨應雨妍