免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗方法。有别于直接靶向肿瘤细胞的常规治疗方法，免疫治疗通过调节和激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能来杀灭肿瘤细胞。其中，以抗CTLA-4和PD-1单抗为代表的免疫检查点抑制疗法，通过解除肿瘤免疫耐受、增强CD8+T细胞功能进而清除肿瘤细胞，成为当前肿瘤治疗的热点[1]。
近年来，研究人员们又发现微生物及其代谢产物，对人体健康，尤其是肿瘤治疗，有着超乎想象的影响。越来越多的研究表明，肠道微生物群能调节免疫治疗的疗效[2]。
近日，日本顺天堂大学竹田和由教授领衔的研究团队，发现德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1，也就是酸奶里常见的保加利亚乳杆菌，能分泌胞外多糖，通过Gro3P基团结合CD8+T细胞表面的LPA受体，诱导CCR6表达，对表达CCL20的肿瘤，增强免疫检查点抑制剂的抗癌效果。研究结果[3]发表在国际顶级医学期刊Cancer Discovery上。
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CD8+T细胞是肿瘤免疫的主要效应细胞，与肿瘤细胞直接接触，产生穿孔素和γ干扰素等效应分子，凋亡和清除肿瘤细胞。因此，促进CD8+T细胞进入肿瘤组织，是实现肿瘤免疫治疗的关键[4]。
而T细胞的迁移和浸润，则通过其细胞表面的趋化因子受体结合趋化因子进行介导。肠道内的微生物，能通过代谢产物，招募T细胞从肠道迁移到肿瘤，增强抗肿瘤的免疫反应[5]。
保加利亚乳杆菌是酸奶发酵所必需的一种益生菌。既往有研究发现，保加利亚乳杆菌能降低普通感冒和流感的感染风险[6]，还能通过产生胞外多糖，增强小鼠的NK细胞活性并诱导脾细胞产生γ干扰素[7]。
那么，保加利亚乳杆菌是否也能趋化T细胞，从而影响肿瘤的免疫治疗呢？
首先，研究人员获取保加利亚乳杆菌分泌的胞外多糖，口服饲喂正常小鼠后，检测小鼠肠道集合淋巴结中T细胞趋化因子受体的表达情况。结果发现在CD8+T细胞中，趋化因子受体CCR6的表达水平显著上调。在体外，研究人员也观察到了同样的实验结果：用保加利亚乳杆菌胞外多糖刺激脾脏或外周血来源的细胞，CCR6也特异性地在CD8+T细胞中高表达。保加利亚乳杆菌的胞外多糖，能诱导CD8+T细胞表达趋化因子受体CCR6。
随后，研究人员分析了CCR6表达水平与肿瘤预后之间的关系，发现在结直肠癌等患者中，CCR6的高表达与总生存期的延长显著相关。由于趋化因子受体CCR6只有唯一一种配体，趋化因子CCL20，研究人员也检测了CCL20在肿瘤中的表达情况，发现在结直肠癌组织中，CCL20的表达显著升高。这些结果表明，表达CCR6的CD8+T细胞浸润至表达CCL20的肿瘤，可能提示预后良好。
小鼠口服保加利亚乳杆菌胞外多糖（EPS-R1）后，图A：肠道集合淋巴结（PP）内CD8+T细胞的趋化因子受体CCR6的表达水平显著上调；图B：流式细胞仪分析证实CD8+T细胞中CCR6表达上调；图C：生存分析显示CCR6的高表达与结直肠癌（CRAD）等癌症的总生存期的延长显著相关；图D和E：体外用胞外多糖刺激脾细胞时，CCR6的表达比例在CD8+T细胞中明显地选择性增加。
为了验证肿瘤组织中CCR6+CD8+T细胞和CCL20之间的关系，研究人员进行了动物实验。
鉴于CCL20在结直肠癌中高表达，在黑色素瘤中低表达，研究人员分别构建了结直肠癌和黑色素瘤小鼠，作为CCL20不同表达水平的肿瘤模型。口服胞外多糖处理肿瘤小鼠，在结直肠癌组织中，CD8+T细胞表达CCR6的比例随处理时间的延长而升高。这表明，胞外多糖诱导的CCR6+CD8+T细胞，能选择性地浸润至表达CCL20的肿瘤组织。
接下来，研究人员探究了胞外多糖对免疫检查点抑制疗法的影响，使用胞外多糖分别处理结直肠癌或黑色素瘤小鼠，同时给予免疫检查点抑制剂治疗。结果高表达CCL20的结直肠瘤体显著缩小，而低表达CCL20的黑色素瘤瘤体无变化；结直肠癌经抗体中和CCL20后，再予胞外多糖和免疫检查点抑制剂治疗，则瘤体不再缩小；而将黑色素瘤过表达CCL20后，再予胞外多糖和免疫检查点抑制剂处理，则瘤体显著缩小。这些结果表明，胞外多糖依赖CCL20，增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用。
使用胞外多糖分别处理结直肠癌(Colon26)或黑色素瘤(B16F10)小鼠，同时给予免疫检查点抑制剂(aCTLA-4 mAb,aPD-1 mAb)治疗。图G:高表达CCL20的结直肠癌瘤体显著缩小，图H:低表达CCL20的黑色素瘤瘤体无变化，图I将:黑色素瘤过表达CCL20后，则瘤体显著缩小，图J:结直肠癌经抗体中和CCL20后，则瘤体不再缩小。
然而，保加利亚乳杆菌的胞外多糖，又是如何增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应？
在体外，胞外多糖处理肿瘤细胞，既不诱导细胞死亡也不抑制细胞增殖，表明胞外多糖并非直接作用于肿瘤细胞来增强抗肿瘤免疫反应。
在肿瘤微环境中，CD8+T细胞可产生γ干扰素等细胞因子提高对肿瘤细胞的杀伤能力。于是，研究人员敲除了γ干扰素基因，观察胞外多糖对肿瘤的影响。
敲除结直肠癌小鼠的γ干扰素基因后，饲喂胞外多糖，则不再对免疫检查点抑制剂产生抗肿瘤增强作用。
转录组测序也发现，胞外多糖处理免疫检查点抑制剂治疗的结直肠癌，γ干扰素以及CXCR3等干扰素生成相关基因的转录水平也上调。
这些结果表明，胞外多糖诱导的CCR6+CD8+T细胞，对免疫检查点抑制剂抗肿瘤的增强效应，是通过γ干扰素介导的。
图A：γ干扰素的体外敲除不影响胞外多糖诱导产生CCR6+CD8+T细胞，图B：γ干扰素的体内敲除使得胞外多糖丧失了对免疫检查点抑制剂的抗肿瘤增强作用，图C：胞外多糖联合免疫检查点抑制剂治疗结直肠癌，γ干扰素以及CXCR3等干扰素生成相关基因的转录水平上调。
保加利亚乳杆菌的胞外多糖中存在基团3-磷酸甘油(Gro3P)，既往有研究发现Gro3P具有免疫调节活性。据此，研究人员推测，Gro3P是胞外多糖发挥抗肿瘤增强效应的功能基团。
研究人员把去除了Gro3P的胞外多糖口服饲喂小鼠，发现小鼠肠道集合淋巴结内CD8+T细胞中，CCR6+群体没有增加，而且也丧失对免疫检查点抑制剂抗肿瘤的增强作用。这证实了Gro3P是胞外多糖增强免疫检查点抑制剂抗肿瘤效应的关键。
Gro3P能结合溶血磷脂酸（LPA）受体，而CD8+T细胞表达LPA受体。因此，研究人员再次推测，CD8+T细胞的LPA受体介导了胞外多糖对CCR6表达的诱导。
研究人员进行了体外实验，首先使用LPA受体激动剂RP-1处理CD8+T细胞，发现CCR6表达上调，而敲除CD8+T细胞的LPA受体，则胞外多糖不能上调CCR6的表达。这证实了LPA受体是CD8+T细胞表达CCR6的必要条件。
图C：胞外多糖和LPA都存在Gro3P基团，图E：质谱检测胞外多糖存在Gro3P基团，图I：LPA受体激动剂RP-1能上调CD8+T细胞表达CCR6,图J：敲除CD8+T细胞的LPA受体（Lpar2）,胞外多糖不能上调CCR6的表达。
综上所述，保加利亚乳杆菌依靠胞外多糖的Gro3P基团，与CD8+T细胞表面的LPA受体结合，诱导趋化因子受体CCR6表达，促进CCR6+CD8+T细胞浸润至表达趋化因子CCL20的肿瘤，产生γ干扰素，维持T细胞功能，增强免疫检查点抑制剂的抗癌效果。
既往有研究发现，酸奶的摄入与结直肠癌的风险降低有关[9]。现在，竹田教授团队发现，酸奶发酵所用的保加利亚乳杆菌能分泌胞外多糖，增强免疫检查点抑制剂的抗癌效果。但是，本研究的结果和结论只是基于实验动物鼠。然而，与啮齿动物相比，人类的基因更多样化，接触的微生物也更多样化，在人类中，微生物群和宿主之间的交叉对话要比小鼠的复杂得多，因此，对于“酸奶抗癌”，还需审慎看待和进一步的验证。
参考文献：
[1] Brunner-Weinzierl MC, Rudd CE. CTLA-4 and PD-1 Control of T-Cell Motility and Migration: Implications for Tumor Immunotherapy. Front Immunol. 2018;9:2737. Published 2018 Nov 27. doi:10.3389/fimmu.2018.02737
[2] Iida N, Dzutsev A, Stewart CA, et al. Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment. Science. 2013;342(6161):967-970. doi:10.1126/science.1240527
[3] Kawanabe-Matsuda H, Takeda K, Nakamura M, et al. Dietary Lactobacillus-derived exopolysaccharide enhances immune checkpoint blockade therapy [published online ahead of print, 2022 Feb 17]. Cancer Discov. 2022;candisc.0929.2021. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0929
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[5] Klaenhammer TR, Kleerebezem M, Kopp MV, Rescigno M. The impact of probiotics and prebiotics on the immune system. Nat Rev Immunol. 2012;12(10):728-734. doi:10.1038/nri3312
[6] Guillemard E, Tondu F, Lacoin F, Schrezenmeir J. Consumption of a fermented dairy product containing the probiotic Lactobacillus casei DN-114001 reduces the duration of respiratory infections in the elderly in a randomised controlled trial. Br J Nutr. 2010;103(1):58-68. doi:10.1017/S0007114509991395
[7] Makino S, Sato A, Goto A, et al. Enhanced natural killer cell activation by exopolysaccharides derived from yogurt fermented with Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1. J Dairy Sci. 2016;99(2):915-923. doi:10.3168/jds.2015-10376
[8] Kitazawa H, Harata T, Uemura J, Saito T, Kaneko T, Itoh T. Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Int J Food Microbiol. 1998;40(3):169-175. doi:10.1016/s0168-1605(98)00030-0
[9] Zhang K, Dai H, Liang W, Zhang L, Deng Z. Fermented dairy foods intake and risk of cancer. Int J Cancer. 2019;144(9):2099-2108. doi:10.1002/ijc.31959
责任编辑丨应雨妍