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反刍動物惡性良性腫瘤胃原生動物的分離培養及形态學分析
原生動物與瘤胃内容物的分離及形态學分析
高健， 陳永康， 王孟志， 王洪榮
揚州大學動物科學技術學院，江蘇揚州
：： 時事通訊作者電子郵件： [email protected]
摘要： 反刍動物惡性良性腫瘤胃中含有大量的原生動物，對維持惡性良性腫瘤胃微生态環境的穩定、促進飼料分解發酵起着重要作用。胃腸病主要有内毛屬、雙毛屬、異毛屬、頭毛屬和前毛屬，其細胞核的數量和形狀是分類的重要名額。本文在厭氧工作站中，用顯微鏡對原生動物細胞進行分選，然後培養惡性良性腫瘤胃腸癌，最後在顯微鏡下進行惡性良性腫瘤胃腸病學家的形态學分析。
關鍵詞： 胃腸病， 微生物分離， 形态分析
材料和試劑
1.16 × 150 mm 培養管（帶橡膠塞）
2. 毛細管吸管
3. 大直徑吸管
4. 幻燈片
5. 紗布
6.CO2氣體，純度為99.999%
7. 二氫磷酸鉀，K2HPO4
8. 二氫磷酸鉀， KH2PO4
9. 硫酸铵（NH4） 2SO4
10. 氯化鈉、氯化鈉
11. 硫酸鎂，MgSO4
12. 氯化鈣二水合物，氯化鈣2H2 O
13. 半胱氨酸
14. 碳酸鈉，Na2 CO2
15.刀鋒天綠
16. 乙酸鈉，CH3COONa
17. 碳酸氫鈉，NaHCO3
18. 小麥粉
19. 鴨粉
20.無氧稀釋溶液（見溶液配方）
21. 培養液M（見溶液式）
22. 培養液SP（見溶液配方）
23. 基底懸浮液（見溶液配方）
儀器和裝置
1.40眼篩
2. 解剖顯微鏡
3. 溫水浴
4. 厭氧工作站
5. 離心機
實驗步驟
1.晨喂後，采用負壓裝置從裝有永久性瘘的反刍胃收集惡性良性腫瘤胃液，經過雙層紗布過濾後，放入裝有CO2和39°C的瓶子中預熱保溫瓶中送回實驗室。
2.過濾後的惡性良性腫瘤胃液進入厭氧工作站，采用厭氧稀釋液依次進行10倍梯度稀釋（10-2、10-3或其他倍數，以每計數網格6~8個原生動物為準），将稀釋後的惡性良性腫瘤胃液置于厭氧工作站39°C處儲存。
3.将0.1mL稀釋的惡性良性腫瘤胃液吸收到載玻片中，在厭氧工作站（100×）中通過顯微鏡并分離原生動物。
4.将單個原生動物細胞在顯微鏡下吸收到毛細管中，在轉移到培養管以檢查原生動物細胞的存活情況之前，将原生動物細胞轉移到16×150mm培養管中，每個培養管放置1至3個細胞。
5.向培養管中加入10mL培養液（根據不同先原的生長狀況選擇不同的培養液，如前者毛狀後代使用培養液M培養生長較好，内毛後龍适合使用培養液SP培養生長更好）和1 mL底物懸浮液， 厭氧密閉培養管，培養管以10度角在39°C的厭氧工作站中培養。
6.每天在厭氧工作站向培養管中加入0.1mL底物懸浮液，在解剖顯微鏡下觀察原生動物的生長狀況，每計數網格生長至6~8個原生動物。
7.在厭氧工作站中，每周将培養的原生動物轉移到新培養管中兩次，使用大直徑吸管吸收5mL培養液，加入到已經裝有5mL新鮮培養液和0.1mL底物懸浮液的培養管中，接種到新培養管後，每日觀察， 每隻原始昆蟲計數6到8隻。
8.使用解剖顯微鏡，在擴大4，00×的條件下，可以根據原生動物的大小和形态來鑒定培養的原生動物，具體形式可以參考Dehority（1993）中常見原生動物的模式和圖檔以及注意事項。
預防 措施
惡性良性腫瘤胃中常見的原生動物形态特征：
1.Entodinium屬的平均體型約為2-168米×13-104米，身體纖毛大多消失，隻有一小部分纖毛在前體表中具有複合纖毛帶，可擴充。蝸杆體的起點是直的，蝸杆體6側朝向隔開，口位于前部，杆狀的大芯在右側。一個收縮氣泡，無骨，一些物種有尾巴。纖毛蟲屬占很大比例，約占50%。
圖1 Entodinium屬原始蠕蟲形态圖（400×）
2.Diplodinium近似為正方形（77-86μm×53-61μm），取向為6個區域，芯前端厚度大，形狀複雜，位于主體左側，染色邊界不明顯，小芯一般位于大芯上。身體前方有兩條複合纖毛帶，分别是嘴巴和身體的左前方，其間有一個明顯凸起的頂蓋。大多數有兩個收縮氣泡，沒有骨闆或尾巴。
圖2 原生動物雙氧鎓（400×）
3.異翅蟲具有簡單的形态，并且較大（108-207 sm×73-128 sm），但具有薄壁（10 nm）。形狀如扁平的雞蛋，體面覆寫着等長纖維。有口、微彎棒狀大芯、小芯、1-4個收縮泡。
圖3 異種原生動物形态圖（400×）
4.眼球層較大（140-160μm×80-110 m），呈錐形或不規則，較硬。背纖毛帶有2條纖毛帶，在身體中心形成絲帶狀形狀。有9個收縮氣泡，排列成2列，沒有蓋子，有3個骨闆，2個在身體上，一個在身體的右側，身體後面有不同數量的尾巴刺痛。
圖4 眼球原蟲圖（400×）
5.Epidinium又大又長（80-150μm×40-70μm），後端呈錐形。有兩條纖毛帶，均在機身前部，靠近口纖毛帶至上，後部左纖毛帶從頂部1/5處，2個收縮氣泡柱在杆狀大芯左前、後，小芯位于左前溝的大芯。沒有帽子，三個骨闆，有或沒有尾巴。
圖5 前外延原生動物圖（400×）
6.骨架體為橢圓形（100-130米×50-60米），其特征在于大骨闆占據了蠕蟲上半身的大部分。正面有兩條纖毛帶。大芯棒更長，左側中間有一個凹陷，裡面有一個小核心。超過6個收縮氣泡柱，左側有大芯。
圖6 Osteracodinium原生動物圖（400×）
溶液配方
1. 厭氧稀釋（布萊恩特和伯克伊，1953）
100 mL無氧稀釋液含有45 mL礦物液No.1（0.3%K2HPO4），45 mL礦物液體No.2（0.3%KH2PO4，0.6%（NH4）2SO4，0.6%NaCl，0.06%MgSO4和0.08%CaCl2.2H2O），加入1.67 mL 3%半胱氨酸，5 mL 0.3%碳酸鈉溶液，加入蒸餾水至100 mL。此外，無氧稀釋液還含有0.0001%的邊緣。将稀釋液置于高壓釜蒸汽滅菌器中滅菌（121°C，0.1MPa滅菌20分鐘），當滅菌器打開時，立即用無菌橡膠塞關閉稀釋液，直至稀釋溫度冷卻至45~50°C，用CO2填充溶液至飽和。
2. 文化 M （Dehority， 1998）
M 含有 50 mL 混合礦物溶液 M （6.0 g/L NaCl、0.2 g/L MgSO4、0.26 g/L CaCl2.2H2O 和 2.0 g/L KH2PO4）每 100 mL 培養液 M （6.0 g/L NaCl）、5 mL 1.1 5% 乙酸鈉溶液、8.33 mL 6% 碳酸氫鈉溶液、26 mL 蒸餾水、10 mL 惡性良性腫瘤胃液（惡性良性腫瘤胃液由 2 層紗布過濾， 1，000×g離心10分鐘後上層液體），0.67mL含有3%半胱氨酸溶液（厭氧膽性在氮氣條件下儲存在無菌離心管中，直到使用前除去）。半胱氨酸在加入培養液前應通過CO2混合15~20分鐘，必要時可使用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調節溶液pH至6.6~6.8，然後在厭氧條件下加入含3%半胱氨酸溶液。使用高壓蒸汽滅菌器（121°C，0.1MPa滅菌20分鐘）對培養M進行滅菌。
3. Culture Liquid SP （Dehority， 1998）
Sp含有25 mL混合礦物溶液SP-1（20 g / L K2HPO4）和25 mL混合礦物質溶液SP-2（16 g / L KH2PO4，4.0 g / L NaCl，0.212 g / L Ca）Cl2.2H2O和0.154 g / L MgSO4），10 mL惡性良性腫瘤胃液（惡性良性腫瘤胃液由2層紗布過濾，1，000×g離心10分鐘後）， 10 mL 6%碳酸氫鈉溶液，29.33 mL蒸餾水，0.67 mL含3%半胱氨酸溶液（在氮氣條件下厭氧儲存在無菌離心管中，直到使用前除去）。半胱氨酸在加入培養液前應混合通過CO2 15~20 min，必要時可使用NaOH或HCl調節溶液pH至6.6~6.8，然後在厭氧條件下加入含有3%半胱氨酸的溶液。使用高壓蒸汽滅菌器（121°C，0.1MPa滅菌20分鐘）對培養SP進行滅菌。
4. 基材懸浮液
每100毫升蒸餾水中加入1.5克小麥粉，1.0克鴨粉制成基質懸浮液，小麥粉和鴨粉粉通過40至60個目标标準篩壓碎，基質懸浮液通過CO215至20分鐘，以確定厭氧。基質懸浮液使用高壓蒸汽滅菌器（121°C，0.1MPa滅菌20分鐘）滅菌。底物懸浮液在使用前被冷凍和解凍。
謝謝
1.感謝國家自然科學基金（30771567）對本次實驗的支援。
2. 王孟志， 程鑫， 謝文文， 張伯松， 劉翔， 王洪榮.（2010）. 體外研究不同潤滑脂對惡性良性腫瘤胃原生動物吞噬的細菌微循環的影響.中國農業科學， 43 （18）： 3831-3837.
3. 王夢芝.山羊惡性良性腫瘤胃腸病與細菌吞噬作用的關系及微生物AA變化機制研究.揚州大學， 2008.
4. 感謝揚州大學動物科學技術學院王夢芝的研究工作，對本次實驗有很大的幫助。
引用
1.Dehority， B. A. （1998）.Epidinium caudatum和Entodinium caudatum的生成時間，通過以不同的時間間隔在體外确定。醫學雜志 76（4）：1189-1196。
2.布萊恩特，M.P.，伯基，L.A.（1953）。牛瘤胃中一些較多的細菌群的培養方法和一些特征。乳品科學雜志36：205-217。
3.Dehority， B. A. （1993）。實驗室手冊關于瘤胃胞漿原生動物的分類和形态學。CRC出版社，佛羅裡達州博卡拉頓。
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