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反刍动物肿瘤胃原生动物的分离培养及形态学分析
原生动物与瘤胃内容物的分离及形态学分析
高健， 陈永康， 王孟志， 王洪荣
扬州大学动物科学技术学院，江苏扬州
：： 时事通讯作者电子邮件： [email protected]
摘要： 反刍动物肿瘤胃中含有大量的原生动物，对维持肿瘤胃微生态环境的稳定、促进饲料分解发酵起着重要作用。胃肠病主要有内毛属、双毛属、异毛属、头毛属和前毛属，其细胞核的数量和形状是分类的重要指标。本文在厌氧工作站中，用显微镜对原生动物细胞进行分选，然后培养肿瘤胃肠癌，最后在显微镜下进行肿瘤胃肠病学家的形态学分析。
关键词： 胃肠病， 微生物分离， 形态分析
材料和试剂
1.16 × 150 mm 培养管（带橡胶塞）
2. 毛细管吸管
3. 大直径吸管
4. 幻灯片
5. 纱布
6.CO2气体，纯度为99.999%
7. 二氢磷酸钾，K2HPO4
8. 二氢磷酸钾， KH2PO4
9. 硫酸铵（NH4） 2SO4
10. 氯化钠、氯化钠
11. 硫酸镁，MgSO4
12. 氯化钙二水合物，氯化钙2H2 O
13. 半胱氨酸
14. 碳酸钠，Na2 CO2
15.刀锋天绿
16. 乙酸钠，CH3COONa
17. 碳酸氢钠，NaHCO3
18. 小麦粉
19. 鸭粉
20.无氧稀释溶液（见溶液配方）
21. 培养液M（见溶液式）
22. 培养液SP（见溶液配方）
23. 基底悬浮液（见溶液配方）
仪器和设备
1.40眼筛
2. 解剖显微镜
3. 温水浴
4. 厌氧工作站
5. 离心机
实验步骤
1.晨喂后，采用负压装置从装有永久性瘘的反刍胃收集肿瘤胃液，经过双层纱布过滤后，放入装有CO2和39°C的瓶子中预热保温瓶中送回实验室。
2.过滤后的肿瘤胃液进入厌氧工作站，采用厌氧稀释液依次进行10倍梯度稀释（10-2、10-3或其他倍数，以每计数网格6~8个原生动物为准），将稀释后的肿瘤胃液置于厌氧工作站39°C处保存。
3.将0.1mL稀释的肿瘤胃液吸收到载玻片中，在厌氧工作站（100×）中通过显微镜并分离原生动物。
4.将单个原生动物细胞在显微镜下吸收到毛细管中，在转移到培养管以检查原生动物细胞的存活情况之前，将原生动物细胞转移到16×150mm培养管中，每个培养管放置1至3个细胞。
5.向培养管中加入10mL培养液（根据不同先原的生长状况选择不同的培养液，如前者毛状后代使用培养液M培养生长较好，内毛后龙适合使用培养液SP培养生长更好）和1 mL底物悬浮液， 厌氧密闭培养管，培养管以10度角在39°C的厌氧工作站中培养。
6.每天在厌氧工作站向培养管中加入0.1mL底物悬浮液，在解剖显微镜下观察原生动物的生长状况，每计数网格生长至6~8个原生动物。
7.在厌氧工作站中，每周将培养的原生动物转移到新培养管中两次，使用大直径吸管吸收5mL培养液，加入到已经装有5mL新鲜培养液和0.1mL底物悬浮液的培养管中，接种到新培养管后，每日观察， 每只原始昆虫计数6到8只。
8.使用解剖显微镜，在扩大4，00×的条件下，可以根据原生动物的大小和形态来鉴定培养的原生动物，具体形式可以参考Dehority（1993）中常见原生动物的模式和图片以及注意事项。
预防 措施
肿瘤胃中常见的原生动物形态特征：
1.Entodinium属的平均体型约为2-168米×13-104米，身体纤毛大多消失，只有一小部分纤毛在前体表中具有复合纤毛带，可扩展。蜗杆体的起点是直的，蜗杆体6侧朝向隔开，口位于前部，杆状的大芯在右侧。一个收缩气泡，无骨，一些物种有尾巴。纤毛虫属占很大比例，约占50%。
图1 Entodinium属原始蠕虫形态图（400×）
2.Diplodinium近似为正方形（77-86μm×53-61μm），取向为6个区域，芯前端厚度大，形状复杂，位于主体左侧，染色边界不明显，小芯一般位于大芯上。身体前方有两条复合纤毛带，分别是嘴巴和身体的左前方，其间有一个明显凸起的顶盖。大多数有两个收缩气泡，没有骨板或尾巴。
图2 原生动物双氧鎓（400×）
3.异翅虫具有简单的形态，并且较大（108-207 sm×73-128 sm），但具有薄壁（10 nm）。形状如扁平的鸡蛋，体面覆盖着等长纤维。有口、微弯棒状大芯、小芯、1-4个收缩泡。
图3 异种原生动物形态图（400×）
4.眼球层较大（140-160μm×80-110 m），呈锥形或不规则，较硬。背纤毛带有2条纤毛带，在身体中心形成丝带状形状。有9个收缩气泡，排列成2列，没有盖子，有3个骨板，2个在身体上，一个在身体的右侧，身体后面有不同数量的尾巴刺痛。
图4 眼球原虫图（400×）
5.Epidinium又大又长（80-150μm×40-70μm），后端呈锥形。有两条纤毛带，均在机身前部，靠近口纤毛带至上，后部左纤毛带从顶部1/5处，2个收缩气泡柱在杆状大芯左前、后，小芯位于左前沟的大芯。没有帽子，三个骨板，有或没有尾巴。
图5 前外延原生动物图（400×）
6.骨架体为椭圆形（100-130米×50-60米），其特征在于大骨板占据了蠕虫上半身的大部分。正面有两条纤毛带。大芯棒更长，左侧中间有一个凹陷，里面有一个小核心。超过6个收缩气泡柱，左侧有大芯。
图6 Osteracodinium原生动物图（400×）
溶液配方
1. 厌氧稀释（布莱恩特和伯克伊，1953）
100 mL无氧稀释液含有45 mL矿物液No.1（0.3%K2HPO4），45 mL矿物液体No.2（0.3%KH2PO4，0.6%（NH4）2SO4，0.6%NaCl，0.06%MgSO4和0.08%CaCl2.2H2O），加入1.67 mL 3%半胱氨酸，5 mL 0.3%碳酸钠溶液，加入蒸馏水至100 mL。此外，无氧稀释液还含有0.0001%的边缘。将稀释液置于高压釜蒸汽灭菌器中灭菌（121°C，0.1MPa灭菌20分钟），当灭菌器打开时，立即用无菌橡胶塞关闭稀释液，直至稀释温度冷却至45~50°C，用CO2填充溶液至饱和。
2. 文化 M （Dehority， 1998）
M 含有 50 mL 混合矿物溶液 M （6.0 g/L NaCl、0.2 g/L MgSO4、0.26 g/L CaCl2.2H2O 和 2.0 g/L KH2PO4）每 100 mL 培养液 M （6.0 g/L NaCl）、5 mL 1.1 5% 乙酸钠溶液、8.33 mL 6% 碳酸氢钠溶液、26 mL 蒸馏水、10 mL 肿瘤胃液（肿瘤胃液由 2 层纱布过滤， 1，000×g离心10分钟后上层液体），0.67mL含有3%半胱氨酸溶液（厌氧胆性在氮气条件下储存在无菌离心管中，直到使用前除去）。半胱氨酸在加入培养液前应通过CO2混合15~20分钟，必要时可使用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节溶液pH至6.6~6.8，然后在厌氧条件下加入含3%半胱氨酸溶液。使用高压蒸汽灭菌器（121°C，0.1MPa灭菌20分钟）对培养M进行灭菌。
3. Culture Liquid SP （Dehority， 1998）
Sp含有25 mL混合矿物溶液SP-1（20 g / L K2HPO4）和25 mL混合矿物质溶液SP-2（16 g / L KH2PO4，4.0 g / L NaCl，0.212 g / L Ca）Cl2.2H2O和0.154 g / L MgSO4），10 mL肿瘤胃液（肿瘤胃液由2层纱布过滤，1，000×g离心10分钟后）， 10 mL 6%碳酸氢钠溶液，29.33 mL蒸馏水，0.67 mL含3%半胱氨酸溶液（在氮气条件下厌氧储存在无菌离心管中，直到使用前除去）。半胱氨酸在加入培养液前应混合通过CO2 15~20 min，必要时可使用NaOH或HCl调节溶液pH至6.6~6.8，然后在厌氧条件下加入含有3%半胱氨酸的溶液。使用高压蒸汽灭菌器（121°C，0.1MPa灭菌20分钟）对培养SP进行灭菌。
4. 基材悬浮液
每100毫升蒸馏水中加入1.5克小麦粉，1.0克鸭粉制成基质悬浮液，小麦粉和鸭粉粉通过40至60个目标标准筛压碎，基质悬浮液通过CO215至20分钟，以确保厌氧。基质悬浮液使用高压蒸汽灭菌器（121°C，0.1MPa灭菌20分钟）灭菌。底物悬浮液在使用前被冷冻和解冻。
谢谢
1.感谢国家自然科学基金（30771567）对本次实验的支持。
2. 王孟志， 程鑫， 谢文文， 张伯松， 刘翔， 王洪荣.（2010）. 体外研究不同润滑脂对肿瘤胃原生动物吞噬的细菌微循环的影响.中国农业科学， 43 （18）： 3831-3837.
3. 王梦芝.山羊肿瘤胃肠病与细菌吞噬作用的关系及微生物AA变化机制研究.扬州大学， 2008.
4. 感谢扬州大学动物科学技术学院王梦芝的研究工作，对本次实验有很大的帮助。
引用
1.Dehority， B. A. （1998）.Epidinium caudatum和Entodinium caudatum的生成时间，通过以不同的时间间隔在体外确定。医学杂志 76（4）：1189-1196。
2.布莱恩特，M.P.，伯基，L.A.（1953）。牛瘤胃中一些较多的细菌群的培养方法和一些特征。乳品科学杂志36：205-217。
3.Dehority， B. A. （1993）。实验室手册关于瘤胃胞浆原生动物的分类和形态学。CRC出版社，佛罗里达州博卡拉顿。
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