四聚体抗体复合物和亲和标签肽用于选择性固定和成像单个量子点
引言：半导体胶体量子点（QDs）作为生物分析和成像应用的荧光标记物。单颗粒测量已被证明是理解QDs及其生物共轭体的基本特性和行为的有力工具。
将QDs固定在类似溶液的环境中，以最小化与大面积表面的相互作用。在这种情况下，QD-肽共轭物的固定策略尤其不成熟。使用多个亲和标签序列可以实现对多种颜色的QDs的控制固定。
单粒子测量是了解QDs及其生物共轭物性质和行为的强大工具，这些信息往往被集合平均和样品的异质性所掩盖。相应地，QDs已被证明是单分子成像、跟踪和传感的优秀发射体，可提供对生化和生物物理过程的详细洞察。
鉴于大多数单分子和单粒子测量需要对发射体进行固定，因此需要一系列多样化和优化的固定化方法来处理QDs及其生物共轭物。
实际上，已经开发出许多策略来固定单个QDs在基板上。其中两种最简单的方法是将稀溶液中的QDs滴落或旋涂到基板上以进行吸附。将QDs嵌入聚合物或凝胶基质是另一种常用的方法。在模拟类似溶液和生物环境、在测量过程中改变环境以及绑定或释放QDs以进行基于单粒子计数的测定方面可能存在局限性。
固定化完全是通过自发的亲和相互作用驱动的。玻璃盖片的表面被覆盖上康卡那瓜凝集素A（ConA，一种与葡聚糖等碳水化合物结合的凝集素）的吸附层，形成了下一层。
葡聚糖（Dex）具有非常亲水性，在防止非特异性结合方面通常很有效。QDs被包覆有谷胱甘肽（GSH）配体，以实现胶体稳定的水溶分散，并与含有高亲和力抗体可识别的亲和标记氨基酸序列的肽共轭。
表面化学和TAC介导的与亲和标记肽共轭的QDs固定化的模型。 QD，肽（4.5 kDa），抗体（每个抗标剂和抗Dex约150 kDa），以及ConA（104 kDa）蛋白按比例绘制。葡聚糖的大小是近似的。亲和标记肽中的亲和标记序列与抗-标记抗体之间的结合的近景视图。
优化的V5标记肽（zwV5）的序列包括一个多组氨酸标记序列，用于与无机表面的QD自发结合，一个多脯氨酸间隔序列，以及一个带电离性的天冬氨酸-赖氨酸序列，以增强胶体稳定性并减少非特异性结合。在先前的研究中，多组氨酸-多脯氨酸序列已广泛用于与QD结合的肽偶联。
通过与抗-Dex和抗-V5结合在表面结合的葡聚糖和QD-肽共轭物中的V5序列，固定化了QD。HA标记和FLAG标记肽的设计类似。一般预期抗-标记抗体与其亲和标记的结合常数Kd≤1 nM，并且对于更多的标记序列重复，Kd会更有利。TAC中抗-Dex和桥接抗体的Kd值是未知的。
预计多组氨酸序列与QD表面的结合常数Kd < 10 nM。使用椭圆测微术和水接触角测量对玻璃盖片进行ConA和Dex的修饰进行了表征。
在具有二氧化硅表面层的硅片上进行测量（作为玻璃的反射代理），ConA膜厚度为8.7±1.4 nm，表明近似为一层覆盖，并增加到ConA/Dex的15.9±2.1 nm。静态接触角从清洁的玻璃盖片的3°变为ConA膜的42°，再变为ConA/Dex的13°。
对ConA/Dex表面化学修饰进行了评估，以限制QDs和QD-zwV5共轭物的非特异性结合。同时还评估了其他几种表面化学修饰：仅ConA（不含Dex），作为衡量随后添加的Dex层效果的对照；亲和素和牛血清白蛋白（BSA），它们是用于单分子和单粒子成像的常见蛋白质层。
聚乙烯亚胺（PEI）阳离子聚合物，预计通过与QDs上的阴离子GSH配体的静电相互作用产生强烈的非特异性结合。这些化学修饰的沉积通过椭圆测微术和接触角测量进行表征。
结论：通过计算每个视场（FOV）中的单个QD数量，评估了涂有不同表面化学修饰的玻璃盖片上的QDs和QD-zwV5的非特异性结合。对于每个样品，至少在30个不同的FOV上进行了分析。分析结果显示，ConA/Dex覆盖玻璃片的非特异性结合最低（每100 μm2约0.002个QD）。
仅有ConA的表面结合的非特异性结合最高（QD和QD-zwV5分别为每100 μm2>400个和约250个），而亲和素、BSA和PEI修饰表面的非特异性结合水平介于中间（每100 μm2为0.2-115个QD）。ConA和ConA/Dex之间的鲜明对比突出了Dex的良好抗污染特性。
