通过高通量RNA测序法预防苹果的花叶病毒感染
苹果是蔷薇科果树，因为它具有较高的经济价值，所以在世界温带地区广泛种植。然而，苹果树面临着苹果花叶病这一严重的病毒性疾病的威胁，该病在全球范围内广泛分布，给苹果产业造成了重大影响。
而传统的免疫学和分子学方法，如酶联免疫吸附测定、分子杂交和逆转录聚合酶链反应，仅能检测已知的目标病毒，存在一定的局限性。
本研究利用高通量测序技术克服了免疫分子方法的限制，为检测非靶向病毒或未知病毒做出了贡献。这种技术能够通过同时测序大量DNA或RNA片段，从而检测和鉴定多种病毒。
为了进行苹果病毒组分析，从ICAR-中央温带园艺研究所的田间基因库中选择了10-12年树龄的OS、GD和RF三个苹果品种的叶子样本，分为有症状和无症状两组。
使用HiseqIllumina2500测序仪对每个品种的一棵树的混合叶样品进行总RNA的测序。随后使用试剂盒提取两个样品的总RNA，并使用TrueSeqRNA库构建cDNA文库。
从GD、OS和RF两个cDNA文库的IlluminaHiseq测序中获得的原始读数，去除适配器和低质量读数，得到干净的120nt读数。
然后使用分类工具Kaiju对从OS、GD和RF样品中获得的病毒和类病毒读数进行计数。共获得了97个病毒相关的重叠，长度范围为501-3780nt。每个样本中与病毒相关的读段所占的比例在干净读段中的范围为0.05%至1.36%。
其中，OS样本显示较高的病毒相关读取数，病毒相关读段占干净读段的比例为1.36%，类病毒相关读段占比为0.85%。
发现两种苹果品种的病毒和类病毒群落存在差异，并且表现出不同的花叶和坏死症状。在OS样本中，病毒/病毒样重叠群显示与一种类病毒和三种病毒物种的相似性。
这种类病毒在苹果属中被鉴定为苹果黄环病毒。同时检测到的病毒包括伊拉病毒属中的苹果新病毒，以及卡皮洛病毒属和中央凹病毒属中的苹果条斑病毒和苹果斑点病毒。GD样本中也显示出AHVd和三种病毒的存在。
然而，病毒谱包括Ilarvirus属中的ApNMV和苹果花叶病毒，以及Capillovirus属中的ASGV。ApMV与唯一显示马赛克症状的品种相关，而ApNMV存在于显示马赛克和马赛克坏死症状的品种中。
单个病毒读取的分布结果显示，ApMV、ApNMV和ACLSV分别在GD、OS和RF样本的病毒相关读取总量中占主导地位。类病毒相关读数显示GD样品中的类病毒读数更为丰富。
每个样品中存在的单个病毒相关读数的百分比以及从头组装后获得的品种OS、GD和RF中每个单个病毒的病毒重叠群数量范围为32至2。
为了确认高通量测序在两种苹果品种中检测到的病毒的准确性，使用特定引物对病毒进行逆转录聚合酶链反应。
分析结果显示，叶片样本对RNA序列的病毒鉴定呈阳性。五种病毒和类病毒的序列与RNA测序检测到的病毒具有99-100%的相似性，表明这些病毒实际存在于从苹果树中分离的总RNA中。
对每种病毒的重叠群进行BLASTn搜索，并与参考植物病毒数据库比对。在参考基因组中确定与每个重叠群相关的病毒的位置和序列相似性。
确定每种病毒的检测到的总序列长度。成功地获得了三种病毒和一种类病毒的完整基因组序列；AHVd的完整基因组也被重建出来。
利用全基因组进行的系统发育分析显示，分离株被聚类在一个具有小子簇的单一簇中，这表明它们之间存在较高的变异性。
ASGV分离株与日本和巴西分离株之间存在更密切的亲缘关系。而ACLSV的系统发育分析表明，该分离株与来自日本的分离株之间的亲缘关系更为密切，同时存在小亚簇的存在，表明这些分离株之间存在多样性。
在本项研究中，使用RNA测序技术检测到与花叶症状相关的病毒。所以，基于高通量测序的方法将使植物病毒学家能够鉴定和表征已知病毒以及新型和不同的病毒，从而实现健康果园的建设。这种方法能够提供更全面的病毒检测和诊断能力，为果树种植者提供有力的工具来监测和控制病毒感染，从而确保果园的健康和产量稳定。
參考文献：
1.Hu,Y;Shi,H.W;Jing,C.C;Qing,L.FirstreportofcucumbermosaicvirusinfectingappleinChina. J.PlantPathol.
2.Noda,H;Yamagishi,N；NApplenecroticmosaicvirus,anovelilarvirusfrommosaic-diseasedappletreesinJapanand.
3.Verma,R.K;Shafi,W.DetectionofapplemosaicandchloroticleafspotvirusesbyDAS-ELISAfromfarmersorchardsofKashmirvalley.
