四聚體抗體複合物和親和标簽肽用于選擇性固定和成像單個量子點
引言：半導體膠體量子點（QDs）作為生物分析和成像應用的熒光标記物。單顆粒測量已被證明是了解QDs及其生物共轭體的基本特性和行為的有力工具。
将QDs固定在類似溶液的環境中，以最小化與大面積表面的互相作用。在這種情況下，QD-肽共轭物的固定政策尤其不成熟。使用多個親和标簽序列可以實作對多種顔色的QDs的控制固定。
單粒子測量是了解QDs及其生物共轭物性質和行為的強大工具，這些資訊往往被集合平均和樣品的異質性所掩蓋。相應地，QDs已被證明是單分子成像、跟蹤和傳感的優秀發射體，可提供對生化和生物實體過程的詳細洞察。
鑒于大多數單分子和單粒子測量需要對發射體進行固定，是以需要一系列多樣化和優化的固定化方法來處理QDs及其生物共轭物。
實際上，已經開發出許多政策來固定單個QDs在基闆上。其中兩種最簡單的方法是将稀溶液中的QDs滴落或旋塗到基闆上以進行吸附。将QDs嵌入聚合物或凝膠基質是另一種常用的方法。在模拟類似溶液和生物環境、在測量過程中改變環境以及綁定或釋放QDs以進行基于單粒子計數的測定方面可能存在局限性。
固定化完全是通過自發的親和互相作用驅動的。玻璃蓋片的表面被覆寫上康卡那瓜凝集素A（ConA，一種與葡聚糖等碳水化合物結合的凝集素）的吸附層，形成了下一層。
葡聚糖（Dex）具有非常親水性，在防止非特異性結合方面通常很有效。QDs被包覆有谷胱甘肽（GSH）配體，以實作膠體穩定的水溶分散，并與含有高親和力抗體可識别的親和标記氨基酸序列的肽共轭。
表面化學和TAC介導的與親和标記肽共轭的QDs固定化的模型。 QD，肽（4.5 kDa），抗體（每個抗标劑和抗Dex約150 kDa），以及ConA（104 kDa）蛋白按比例繪制。葡聚糖的大小是近似的。親和标記肽中的親和标記序列與抗-标記抗體之間的結合的近景視圖。
優化的V5标記肽（zwV5）的序列包括一個多組氨酸标記序列，用于與無機表面的QD自發結合，一個多脯氨酸間隔序列，以及一個帶電離性的天冬氨酸-賴氨酸序列，以增強膠體穩定性并減少非特異性結合。在先前的研究中，多組氨酸-多脯氨酸序列已廣泛用于與QD結合的肽偶聯。
通過與抗-Dex和抗-V5結合在表面結合的葡聚糖和QD-肽共轭物中的V5序列，固定化了QD。HA标記和FLAG标記肽的設計類似。一般預期抗-标記抗體與其親和标記的結合常數Kd≤1 nM，并且對于更多的标記序列重複，Kd會更有利。TAC中抗-Dex和橋接抗體的Kd值是未知的。
預計多組氨酸序列與QD表面的結合常數Kd < 10 nM。使用橢圓測微術和水接觸角測量對玻璃蓋片進行ConA和Dex的修飾進行了表征。
在具有二氧化矽表面層的矽片上進行測量（作為玻璃的反射代理），ConA膜厚度為8.7±1.4 nm，表明近似為一層覆寫，并增加到ConA/Dex的15.9±2.1 nm。靜态接觸角從清潔的玻璃蓋片的3°變為ConA膜的42°，再變為ConA/Dex的13°。
對ConA/Dex表面化學修飾進行了評估，以限制QDs和QD-zwV5共轭物的非特異性結合。同時還評估了其他幾種表面化學修飾：僅ConA（不含Dex），作為衡量随後添加的Dex層效果的對照；親和素和牛血清白蛋白（BSA），它們是用于單分子和單粒子成像的常見蛋白質層。
聚乙烯亞胺（PEI）陽離子聚合物，預計通過與QDs上的陰離子GSH配體的靜電互相作用産生強烈的非特異性結合。這些化學修飾的沉積通過橢圓測微術和接觸角測量進行表征。
結論：通過計算每個視場（FOV）中的單個QD數量，評估了塗有不同表面化學修飾的玻璃蓋片上的QDs和QD-zwV5的非特異性結合。對于每個樣品，至少在30個不同的FOV上進行了分析。分析結果顯示，ConA/Dex覆寫玻璃片的非特異性結合最低（每100 μm2約0.002個QD）。
僅有ConA的表面結合的非特異性結合最高（QD和QD-zwV5分别為每100 μm2>400個和約250個），而親和素、BSA和PEI修飾表面的非特異性結合水準介于中間（每100 μm2為0.2-115個QD）。ConA和ConA/Dex之間的鮮明對比突出了Dex的良好抗污染特性。
