鈣化主動脈瓣病（CAVD）是一種活躍、細胞驅動、進行性疾病，其特征是瓣膜纖維化增厚，随後發生葉瓣鈣化、瓣膜狹窄，最終導緻心力衰竭和死亡。部分原因是由于缺乏适當的實驗模型來幫助我們建立藥物幹預發展的分子基礎，目前沒有有效的藥物可供使用。主動脈瓣（AV）葉片由其細胞外基質（ECM）組成的三個不同層次定義：富含膠原的纖維層、富含蛋白多糖的海綿層和富含彈性蛋白的心室層。瓣膜間質細胞（VICs）是AV中最常見的細胞類型。在生理條件下，VICs是靜止的類成纖維細胞樣細胞，并通過增殖群組織重塑維持瓣膜的穩态。然而，在病理條件下，這些VICs變得活化，并轉化為肌成纖維細胞樣細胞或促鈣化的成骨細胞樣細胞，在ECM中積極沉積羟基磷灰石。嵌入在更硬的纖維層中的VICs推動鈣化擴散到海綿層，而相對不受影響的是心室層。是以，能夠在易患疾病的纖維層等環境中研究VICs的能力對于增加對CAVD病理學的了解至關重要。在CAVD中，感受力敏感的瓣膜細胞對纖維化和鈣化引起的組織硬化做出反應，進一步推動病理生理過程。由于缺乏（i）能夠重制這種複雜環境的适當實驗模型以及（ii）對新型工程主動脈瓣（AV）模型性能進行基準測試，目前沒有藥物治療CAVD的藥物。
來自美國哈佛大學醫學院的Elena Aikawa團隊建立了一種基于生物材料的CAVD模型，模拟了人類易患纖維層的生物力學特性，并将其3D生物列印到96孔闆中。通過液相色譜串聯質譜分析細胞蛋白質組和囊泡組，比較了3D生物列印模型與傳統的2D單細胞培養模型與人類CAVD組織之間的差異。3D生物列印模型高度重制了CAVD細胞蛋白質組（與2D蛋白質的70%相比，達到94%）。将細胞和囊泡資料集整合起來，識别出與AV鈣化普遍相關的已知和未知蛋白質。哈佛大學醫學院的研究團隊研究探讨了2D和3D生物工程系統如何重制人類疾病的獨特方面，将多組學作為一種評估高通量生物工程模型系統的技術，并為未來的藥物發現提供了潛力。相關工作以題為“Intracellular proteomics and extracellular vesiculomics as a metric of disease recapitulation in 3D-bioprinted aortic valve arrays”的文章發表在2024年2月28日《Science Advances》。
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創新型研究内容
該研究利用細胞和EV蛋白質組學，通過評估作為靜态生物力學特性的函數發生的細胞和EV蛋白質組水準的變化，全面而整體地表征體外模型對該疾病的重制。此外，該研究還開發、驗證并對CAVD發病機制的3D生物工程模型系統進行基準測試，這些模型系統與高通量藥物篩選平台相容。
【高通量生物列印平台建立了一系列具有生物力學相關性的CAVD模型數組】
該研究采用甲基丙烯酰化明膠和透明質酸（GelMA/HAMA）建構了一個水凝膠系統，其中攜帶有初代人類VICs，并根據AV特定的（和疾病驅動的）生物力學進行調節（圖1A和B）。使用的VICs來自人類CAVD組織樣本。生物列印參數經過優化，以适應适用于高通量篩選的96孔闆陣列，顯示出孔井之間的一緻性（圖1B和C）。VICs對ECM的硬度有感覺和響應能力；是以，對于成功的CAVD模型來說，材料硬度的重制必不可少，與原生主動脈瓣層次相一緻。通過調節紫外（UV）固化時間，操控了水凝膠的機械特性，并在96孔闆陣列格式中複制了海綿質（受疾病保護）和纖維質（易患疾病）瓣膜層的力學特性，基于先前的研究并通過納米壓痕分析進行了确認（圖1D和E）。納米壓痕測量的熱圖顯示了水凝膠表面上的空間分辨率一緻性的生物力學測量結果（圖1D），并通過定量分析重制了已知的層特異性生物力學特性（圖1E）。由于鈣化主要發生在主動脈瓣的纖維質層，是以後續的實驗中使用了類纖維層的水凝膠模型。
圖1 主動脈瓣模型的3D生物列印
通過展示在96孔闆生物列印水凝膠陣列中廣泛調節生物力學特性的能力，使其覆寫一系列（病理）生物學相關的硬度範圍，随後的實驗專注于與疾病相關的類纖維層水凝膠，重制了易患疾病的主動脈瓣區域的生物力學特性。先前的研究已經顯示，培養14天後，VIC封裝的水凝膠模型在不同培養條件下的鈣化情況存在顯著差異，借此指導了該研究的培養時間表。在正常培養基（NM）或兩種刺激鈣化的培養基：有機磷酸鹽成骨培養基（OM）或無機磷酸鹽促鈣化培養基（PM）中培養14天後，類纖維層水凝膠中的VIC在所有培養基類型和重複實驗中維持了較高的存活率（圖2A，頂部和B，左側）。瓣膜鈣化可以是不同過程的産物，例如類骨母細胞樣VIC的活性礦物沉積，或與細胞凋亡相關的鈣化，後者通常被認為是體外培養的人工過程。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸核苷酸末端标記（TUNEL）染色顯示，在所有水凝膠和培養條件中，幾乎沒有與細胞凋亡相關的細胞死亡，證明鈣化很可能不是由細胞死亡相關的鈣積累介導的（圖2A，底部和B，右側）。通過使用近紅外鈣示蹤劑（Osteosense680）對類纖維層96孔水凝膠陣列中的鈣化進行了評估。所有的3D陣列培養基條件都顯示了一定程度的Osteosense680陽性染色（圖2C）。然而，在OM和PM條件下，微小鈣化竈數量（圖2D）和信号強度（圖2E）均呈上升趨勢，并且在統計上存在顯著增加。
圖2 在有機磷酸鹽和無機磷酸鹽培養基條件下，培養在類纖維層水凝膠中的VICs保持存活，并誘導鈣化
一旦細胞存活和鈣化誘導得到确認，該研究使用基于質譜的蛋白質組學方法評估了3D生物列印的VIC水凝膠CAVD陣列條件下與傳統的2D VIC單細胞培養條件下分别對原生CAVD組織表型的重制能力（CAVD）（圖3A）。在3D和2D條件下，鑒定出了超過2500種蛋白質，兩種體外模型之間的鑒定蛋白質的重疊率超過99%（圖3B）。為了去除培養準備過程中可能産生的潛在背景污染物，該研究還探究了僅含細胞外水凝膠的蛋白質組，并對其與Hathewaya histolytica（膠原酶來源）、豬（GelMA/HAMA來源）、牛（培養血清來源）和人類（用于識别目标蛋白質組同源性）蛋白質組進行了比對（圖3B）。随後的分析中包括了CAVD組織來源的細胞（圖3C）。未經過濾的主成分分析（PCA）顯示了按模型類型（圖2D）和鈣化培養基處理（圖3E，僅體外）進行的三種蛋白質組的無偏聚類。在2D和3D體外模型之間，測得的蛋白質組中有48%的差異豐度，而CAVD與2D或3D之間的差異豐度不到30%。這表明體外模型的細胞蛋白質組之間的差異比它們與新鮮組織的細胞蛋白質組之間的差異更大（圖3F）。接下來，該研究确定了表征2D和3D條件之間以及體外模型與組織之間關鍵差異的基因本體論（GO）術語（圖3，G’和G”），2D培養中的蛋白質與血小闆聚集、同型細胞間粘附、典型糖酵解和肌動蛋白絲解聚相關，而3D培養中的蛋白質與膠原纖維排列、蛋白質N-和O-糖基化、COPI包被小泡運輸以及線粒體組織相關。最後，分離的CAVD細胞中富集了與調節免疫反應、補體激活和糖脂轉運相關的蛋白質（圖3G），與原生CAVD中存在的免疫細胞浸潤一緻。
圖3 CAVD水凝膠模型的細胞蛋白質組學揭示了模拟病理過程的轉化靶點
該研究的目标是将體外培養的細胞蛋白質豐度與CAVD來源的細胞蛋白質豐度進行相關性分析。成對相關性分析顯示，所有體外培養基條件之間相關性都很高（r > 0.9）。全面的蛋白質組相關性分析顯示，2D和3D細胞與CAVD細胞之間存在顯著相關性（2D ravg = 0.82；3D ravg = 0.79）。接下來，将2D和3D蛋白質豐度與所有培養基條件下的AV資料集進行比較（圖4B和C）。在2D模型中，與原生CAVD相比，NM是具有最多的差異蛋白質，而PM是具有最少的差異蛋白質（圖4B）；與之不同的是，3D陣列中的細胞蛋白質中很少有與CAVD有差異豐度的蛋白質（圖4C）。總體而言，3D模型在94%的測量蛋白質中重制了CAVD細胞蛋白質豐度的特征，而2D模型則重制了70%的蛋白質豐度。這表明3D模型可能在整體上最适合識别在疾病誘導過程中蛋白質豐度變化，這種變化最接近于在原生組織中觀察到的變化。
接下來，該研究使用蛋白質趨勢分析來确定在2D和3D條件下，哪些關鍵蛋白質最能重制CAVD細胞蛋白質組（圖4D至H）。在2D PM條件下，重制CAVD豐度的蛋白質與細胞粘附（CDH13和ARHGDIB）和細胞骨架組織（PACSIN2、CNN2和THY1）相關（圖4D至F）。在3D條件下，OM和PM培養基都重制了與超分子纖維組織（MFAP4、COL18A1和TMOD1）、脂蛋白代謝（APOA1和APOE）、負調節内皮細胞增殖（SCG2、PDCD10）和脂肪酸β-氧化（ATFA和ECHS1）相關的CAVD蛋白質豐度（圖4G至I）。該研究還發現了一組在所有3D培養基條件下與CAVD組織趨勢一緻的蛋白質（圖4G，底部）。這種以細胞蛋白質組為中心的分析無偏地顯示，3D水凝膠陣列重制了在2D單細胞培養中無法捕捉到的疾病的獨特方面。
圖4 3D生物列印模型的細胞蛋白質組能夠最好地重制在鈣化條件下的CAVD細胞病理學
【EV載體蛋白質組學研究發現CAVD病理中的差異負載】
有證據表明，EV在動脈粥樣硬化和CAVD（鈣化性心血管疾病）中發揮着基礎性作用。為了評估EV在體外CAVD模組化中的作用，該研究進行了EV載體蛋白質組學分析。該研究分離了EV并通過納米粒子追蹤分析确定了适當的大小範圍。對分離的EV進行的蛋白質組學分析鑒定出了1300多種蛋白質，其中包括26種常見的EV标記物（圖5A）。主成分分析顯示了模型和培養基标記的EV蛋白質組之間的明顯聚類（圖5B和C）。與細胞蛋白質組學分析不同，所有培養基條件（NM、OM、PM）在體外模型之間産生了類似數量的差異EV載體蛋白質（圖5E）。然而，總體上EV蛋白質組更加穩定：在任何體外模型的任何培養基進行中，隻有平均5%（977個蛋白質中的42個）的總蛋白質豐度存在差異（圖5E），而在NM條件下細胞蛋白質組中有15%存在差異（圖3H）。在2D和3D模型中，所有差異的EV載體蛋白質中，僅有不到4%在不同培養基處理之間共享，這表明每種培養基和模型都具有獨特的負載響應（圖5F至H）。在2D NM模型中，與EV載體的關鍵差異與整合素介導的信号傳導（CD63、FLNA、FERMT2和FERMT3）以及線粒體膜相關的凋亡（YWHA家族）有關（圖5F）。OM EV載體差異與超氧化物調節（PRDX2、APOA4和SOD2）以及細胞外基質組裝（TNXB、PXDN、LAMB1和EMILIN1）有關（圖5G）。最後，PM EV載體的變化與纖溶酶原（ENO1和THBS1）以及細胞外基質（VIM、MFAP4和EMILIN1）有關（圖5H）。
圖5 EV蛋白質組學鑒定了基質依賴的物質加載和普遍存在的與主動脈瓣相關的物質
【多層次組學資料集的整合顯示了CAVD重制的關鍵驅動因素】
在深入描述細胞和EV蛋白質組中的差異豐度模式後，該研究的目标是研究這些蛋白質組之間的關聯模式，以确定在不同刺激條件下3D列印水凝膠模型和2D培養條件中重制CAVD病理的蛋白質。為此，該研究利用了兩種計算分析方法：正則化典型相關分析（rCCA）（圖6）和用于單個樣本的線性插值網絡估計（LIONESS）（圖7），每種方法闡明了不同的關聯方面。首先，該研究旨在檢查細胞和EV資料集中的哪些蛋白質推動了體外鈣化模型和原發性CAVD組織的重制。該研究使用rCCA來識别正交分量或變量之間的最大相關性（圖6A至D）。典型分量1顯示了2D和3D體外模型之間的高相關性，而典型分量2顯示了3D模型和CAVD組織之間的高相關性（圖6A）。相關圓圈圖用于可視化典型分量之間的關系，其中每個點代表細胞或EV蛋白質組中的一個蛋白質（圖6B）。通過對這些資料進行門檻值處理，該研究确定與每個典型分量顯著相關的蛋白質（圖6B和C）。該研究觀察到了具有相同類型相關性的變量（蛋白質）的子集簇（圖6C）。與之相對應的相關網絡顯示了推動鈣化水凝膠和CAVD組織之間相關性的細胞和EV載體蛋白質（圖6D）。該研究發現，雖然EV蛋白質占兩個資料集的比例不到10%，但它們占據了推動CAVD和體外模型中鈣化的蛋白質的30%以上。在被确定為與CAVD組織重制鈣化模型的98%的蛋白質（65個中的64個，P < 0.05，根據精确二項檢驗）之前已被認為與心血管疾病有關（PheGenI，美國國家生物技術資訊中心）。這些綜合的多層次蛋白質組學分析方法确定了鈣化的已知和未知驅動因素，并确定了這種3D水凝膠模型在體外重制CAVD疾病方面的改進。
圖6 通過整合細胞和EV載體衍生的蛋白質組，對鈣化模型中疾病重制的網絡分析進行了研究
最後，該研究旨在利用多組學整合和系統生物學方法，确定在這些模型中與鈣化有關的已知和未知蛋白質。圖7中顯示的網絡是由三種類型的節點構成的頂部加載資訊：比較鈣化模型（案例和圓角正方形）、細胞和EV層的兩個主要成分（鑽石）以及這些主要成分的加載蛋白質（圓圈；黃色代表細胞，粉色代表EV）（圖6A）。根據它們在模型中的共享程度，進一步對蛋白質節點進行分類，網絡從最共享到最特定進行組織排列（圖7的第4到第1層）。在60多個細胞和EV來源的蛋白質中，至少與另一個條件共享（圖7的第2到第4層），突出顯示了獨立于次元或磷酸鹽類型的驅動CAVD模型中鈣化的蛋白質。在這個綜合分析中，僅有四種蛋白質被确認為細胞和EV蛋白質組之間的共享驅動因子，它們是維納蛋白（VTN）、乳糖粘附蛋白（MFGE8）、聚類素（CLU）和鈣蛋白L1H（S100A9）。在無偏子簇中，共享生物過程的蛋白質被分組（圖7）。在三個條件之間共享的細胞和EV蛋白質中，突出的過程包括線粒體代謝（MAOB和MDH1）、細胞-基質粘附（THBS1、SOD3和NID2）以及肌動蛋白絲結合（VIM、MSN、CFL2、SYNE3、TPM4和TMSB4X）。僅有19%（215個中的41個，P < 0.05，根據精确二項檢驗）的蛋白質被确認為先前與瓣膜疾病有關（PheGenI，NCBI）。這個綜合分析突顯了體外鈣化的已知和未知驅動因素。
圖7 将細胞和EV載體衍生的蛋白質組進行多組學整合，對鈣化過程中已知和未知的蛋白質進行差異豐度排名
圖8顯示了每個體外模型中最好重制疾病的生物途徑的圖形摘要。該研究發現3D水凝膠模型能夠重制人類CAVD組織的ECM蛋白質組、細胞-ECM互相作用和線粒體代謝調節的蛋白質譜。然而，無論是2D還是3D模型，在免疫/發炎反應方面都缺乏組織中發現的響應。雖然在瓣膜鈣化的背景下，免疫共培養研究有限，但最近的單細胞研究表明細胞間的跨類型細胞間通信在鈣化性瓣膜疾病中的重要性。該研究提出的模型為進一步增加複雜性提供了基礎，例如共培養其他細胞類型、（病理）生理性周期性剪切/拉伸和額外的層特異性生物力學。雖然我們的研究主要關注纖維層和海綿層的特性，但富含彈性蛋白和受疾病保護的心室内膜在培養條件下已被證明在體内驅動獨特的蛋白質特征，并且很可能主要對應于拉伸而不是壓縮應力的瓣膜生理響應。
圖8 總結每個模型在細胞和EV方面對CAVD組織重制的GO術語
總結與展望
該研究注意到在NM條件下出現了輕度的自發性鈣化，這可能是由于在生物列印過程中暴露于剪切應力和高達75 bar的壓力，這兩者都已被證明可以誘導肌成纖維細胞的活化。此外，本實驗中使用的VICs來自患有疾病的人類瓣膜，可能包含了該研究團隊之前證明的成骨肌成纖維細胞樣細胞的一群細胞。盡管如此，與NM對照組相比，在3D培養中，在鈣化培養基處理條件下，該研究在細胞和EV載體中發現了顯著的蛋白質組學變化，證明了該模型的可行性。該研究利用基于自下而上的蛋白質組學鑒定的肽段的種屬特異性，對細胞外基質（ECM）和其他潛在污染物進行了背景蛋白質組的整理。在未來的研究中，該研究将緻力于使用針對ECM的蛋白質組學技術，來識别對膠原亞型、翻譯後修飾和細胞-基質互相作用的機械響應。這些技術還可用于評估細胞和EV對水凝膠中使用的不同基質微環境的反應。這種EV分析還可以擴充到識别驅動EV與微囊泡分泌及其相應蛋白質組的因素。
文章來源： https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj9793
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