今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Enhancing the Imine Reductase Activity of a Promiscuous Glucose Dehydrogenase for Scalable Manufacturing of a Chiral Neprilysin Inhibitor Precursor”，通訊作者為美國Codexis公司的Xiang Yi。
葡萄糖脫氫酶（GDH）已被廣泛用于從NAD(P)+回收NAD(P)H，同時将d-葡萄糖氧化為葡萄糖酸内酯。作為短鍊脫氫酶/還原酶（SDR）家族的原型成員，GDH被認為是一種高度底物特異性和單功能的酶。最近發現GDH（Rd1bb酶）可以作為環狀亞胺鹽不對稱還原的催化劑。然而，Rd1bb酶和已知IRED的序列比對和結構比較顯示幾乎沒有相似性。對GDH的混雜亞胺還原酶活性的了解顯然是有限的，并且對環狀亞胺鹽以外的底物的反應性到目前為止還沒有研究。
在本研究中，作者報道了偶然發現的GDH的亞胺還原酶活性。在最近的一個酶進化程式中，用(S)-丙氨酸乙酯（1a）還原胺化α-酮酸2a，以在奈普賴氨酸抑制劑的合成中獲得中間體3a，奈普賴素抑制劑是治療頑固性高血壓的候選藥物（方案1），觀察到GDH酶不僅可以催化NAD(P)H的再循環，而且本身可以顯示出IRED樣活性，在還原胺化反應中起催化劑作用。使用最先進的CodeEvolver定向進化技術将GDH酶轉化為IRED。最終的酶催化了所需的還原胺化反應，并達到了預定的效率和選擇性目标。
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發現GDH Rd1bb的亞氨還原酶活性
作者在來源于固醇脫氫酶（ODHs）的Codexis IRED突變體上進行從非天然底物α-酮酸2a和(S)-丙氨酸乙酯（1a）合成所需産物3a的初始酶進化程式。将酶促反應與使用葡萄糖作為末端還原劑的GDH輔因子回收系統偶聯，以實作IRED反應的高轉化率（方案1）。GDH Rd1bb，一種來自枯草芽孢杆菌的工程化GDH，具有顯著提高的熱穩定性和葡萄糖脫氫酶活性，被用作輔因子回收系統。在不存在IRED酶的情況下，通過LC-MS分析檢測到微量的産物信号。通過測試兩種額外的輔因子回收系統，亞磷酸脫氫酶（PDH）和亞磷酸鈉或單獨的NADH，進一步測試了Rd1bb依賴性反應。在不含Rd1bb的反應中未檢測到産物信号，證明Rd1bb确實在催化還原胺化反應。最後，在不含初始IRED酶的反應中測量Rd1bb的劑量反應，證明Rd1bb顯示出IRED樣反應性。
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GDH進化第一輪：GDH對IRED反應性的進化
與對不期望的(S,R)-産物表現出強烈偏好的IRED催化反應相比，Rd1bb的混雜亞胺還原酶活性對期望的(S,S)-非對映異構體表現出低但排他性的偏好。是以，在保持Rd1bb的高非對映選擇性的同時提高活性是進化程式的目标。為了最大限度地提高篩選速度，在每一輪進化中使用對所需産物3a有選擇性的高效RapidFire MS方法來篩選所有文庫。為了確定産物3a的所需非對映選擇性，通過LC-MS進一步驗證所得突變體活性。
作者設計并建構了一個飽和誘變（SM）文庫，靶向葡萄糖結合口袋周圍的33個位置（圖1），以37%的覆寫率産生大約400個突變體。在5當量胺1a的存在下，使用PDH和亞磷酸鈉作為獨立的NADH再循環系統，或者在沒有額外的NADH循環系統的情況下使用濃度為6和20g/L的NAD+和葡萄糖，以1.25g/L的底物2a濃度進行篩選。後一種篩選設定假設了一些新産生的GDH突變體在與IRED同時起作用的同時保留了其氧化葡萄糖的能力。兩種篩選政策都很成功。在高通量篩選（HTP）過程中，發現許多命中活性超過了起始的Rd1bb酶。
大多數有益突變的突變殘基位于葡萄糖結合袋内，如L95A或V、E96A或C、H147I、S、a或Q、F155N或a和F256A、V、T、S、Q或L，或與NAD+密切接觸，如A159C或T（圖1）。值得注意的是，來自相鄰單體的C末端環的F256有助于活性的提高。該位置的多種有益突變突出了其對IRED活性的關鍵影響。通常，向小和/或柔性殘基的突變，這可能會增加結合口袋的大小，進而容納更大的酮和胺底物。第一輪進化的結果證明GDH的亞胺還原酶活性可以提高。盡管總活性仍然很低，但多種突變體顯示出顯著的活性改善，對所需的(S,S)-非對映異構體保持>99%的非對映選擇性。選擇具有優異性能的H147I突變體作為第2輪突變模闆。
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GDH進化第2-4輪：抑制酮還原
在最初的篩選過程中，α-酮酸2a底物的還原超過了所需的亞胺還原酶活性，形成了大量的醇副産物4（圖2a）。醇的形成有三個來源：GDH酶、裂解物的未知背景反應性和NADH的直接化學還原。在第2輪試驗驗證階段，通過将NAD+輔因子濃度從1.5 g/L降低到0.1 g/L（該濃度适合大規模生産），降低了NADH非催化還原的風險。确定的熱點突變體Rd3bb的醇副産物量從50%降至約20%，該突變體被選為第3輪突變模闆（圖2A）。為了補償降低的輔因子濃度并保持足夠高的輔因子回收率，由于較高的周轉率，從第3輪開始，Rd1bb和葡萄糖取代PDH和亞磷酸鈉作為回收系統。
在第3輪和第4輪的篩選目标是同時活性增加和醇形成減少，以指導文庫設計和命中率選擇。通過繪制産物活性與醇副産物的倍數提高的曲線來分析HTP篩選資料，可以容易地識别具有優異化學選擇性的命中物，這表現為産物與醇的比率增加，同時活性增加（圖2B，C）。通過與模闆序列（對于突變文庫的命中）或MOSAIC（對于組合文庫的命中）的直接比較，選擇頂部命中（圖2B，虛線上方）進一步進行了序列活性和序列化學選擇性分析，MOSAIC是一種用于分别去卷積和預測突變對所需IRED活性和化學選擇性的影響的軟體。通過這項工作，鑒定出了有利于提高活性和提高化學選擇性的突變（圖2D，紅色），并進一步用于建構下一輪組合文庫。第3輪和第4輪最高命中分别為Rd4bb和Rd5bb，Rd4bb對醇的進一步抑制低至10%，Rd5bb完全消除了醇，而産品活性不斷上升并占主導地位（圖2A）。從第4輪開始，在篩選和驗證反應中不再檢測到作為副産物的醇4的形成。
值得注意的是，在Rd5bb（I147R）中鑒定的突變是第一輪進化過程中的關鍵突變（Rd1bb和H147I）的逆轉，該突變消除了GDH的葡萄糖脫氫酶活性。His147與Tyr158和Ser145一起被認為構成了催化三元結構，負責通過中繼機制促進從葡萄糖的C1原子到NAD+的煙酰胺部分的氫化物轉移。推測147位的殘基在GDH的催化酮還原酶功能中也起着關鍵作用。I147R突變導緻GDH對底物2a無酮還原酶活性，并同時提高其對産物3a的亞胺還原酶活性。是以，在第5-8輪篩選中，任何攜帶該突變的文庫變體都不太可能産生醇副産物4。
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GDH進化第5-8輪：用于規模制造的進一步改進
雖然在五輪進化中，所需活性和化學選擇性已經取得了重大進展，但進化的GDH酶的亞胺還原酶活性還不足以大規模生産産品3a。在30°C、50 g/Lα-酮酸2a、5倍摩爾過量的(S)-丙氨酸乙酯（1a）、0.1 g/L NAD+、1 g/L Rd1bb和35 g/L d-葡萄糖的條件下，5 g/L酶負荷下的Rd5bb在15小時内僅實作約40%的轉化。是以，在典型的制造條件下，特别是在更高濃度的底物2a和在升高的溫度下減少過量的共底物胺1a的條件下，作者進行進一步的進化以優化性能，進而提高活性和反應速率（表1）。進化的GDH酶的IRED活性持續增加，直到最後一輪。在八輪進化中，篩選了20個文庫和16000多個突變體，靶向99%的所有位置和60%的所有突變。在每一輪進化中，通過靶向酶的特定區域，通過位點飽和誘變文庫引入新的多樣性，并将通過HTP篩選鑒定的有益多樣性重組到下一輪的組合文庫中。組合文庫的命中率通常顯示出優于位點誘變文庫的性能，證明經驗證的有益多樣性的積累以組合的方式提供了逐漸的改進。
在進化過程中，GDH變得更加親水，GDH的表達和溶解度也随之提高，特别是在第4輪和第5輪進化過程中，文庫開始靶向表面位置。與起始的Rd1bb酶相比，最終突變體Rd9bb攜帶29個突變（圖3A），累積活性提高約6.3×106（圖3B）。
作者進一步研究了關鍵工藝參數對GDH突變體的亞胺還原酶活性的影響。包括pH值、NAD+相對于NADP+的輔因子偏好、α-酮酸2a和(S)-丙氨酸乙酯（1a）之間的化學計量、酶的熱穩定性和反應溫度。基于這些結果，使用(S)-丙氨酸乙酯（1a）作為相應的鹽酸鹽，用Rd6bb進行早期工藝開發。在最優條件下，在3小時内實作向目标産物3a的完全轉化。通過HPLC以94%的分離産率和>99%的純度提供産物3a，其為單一立體異構體，er為>99.9:0.1，dr為>99.9-0.1。
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葡萄糖脫氫酶的進化和調節混雜的IRED活性
對于任何混雜的酶，副反應，即GDH情況下的亞胺還原酶活性，相對于主要反應途徑的天然催化活性是緩慢的。本研究表明，應用适當的誘變和篩選政策，可以将以前的混雜活性轉化為未來的主要活性。除了起始的Rd1bb突變體外，當與葡萄糖作為底物和NAD+作為輔因子孵育時，進化模闆沒有顯示出任何可測量的脫氫酶活性（圖4A）。這一觀察結果推斷，GDH在葡萄糖結合位點成為靶點的第一輪進化過程中失去了脫氫酶活性。盡管葡萄糖結合位點的大多數突變對酶的IRED能力沒有有益影響，但葡萄糖結合口袋中的三個殘基E96、H147和F155的變化似乎是有影響的，IRED活性增加了2-4倍（圖4B）。
此外，鑒定從GDH向IRED轉變的關鍵殘基的另一種方法是基于GDH回收輔因子NAD+的功能。在不存在輔因子回收系統的情況下表現出低IRED活性但在存在輔因子循環系統的情況中表現出良好活性的IRED突變體E96、H147和F155失去了天然GDH活性，H147A或H147S突變在消除脫氫酶活性和促進IRED活性方面的關鍵作用。F155N不影響Rd1bb對葡萄糖的氧化，可能是因為該位置遠離葡萄糖氧化的催化位點（圖1）。此外，突變F155N可能降低空間位阻和/或提供更多的電荷互相作用，導緻酶對亞胺中間體的調節性提高，并伴随IRED活性增加。
作者解析了與NAD+結合的Rd1bb酶的晶體結構，并将其用作模闆來對H147S和H147I突變體進行模組化。使用SMINA對葡萄糖進行對接模拟，以進一步研究這些關鍵殘基的結構和功能作用。在Rd1bb模型中，葡萄糖采用每個羟基與包括Tyr158、Glu96、Lys199、Asn196、His147和Ser145的相鄰氨基酸形成氫鍵的構象。H147和葡萄糖的C6羟基之間形成氫鍵，His147本身也與Trp152形成π–π互相作用，可能進一步穩定His147的取向（圖5A）。結果，葡萄糖被定向到與NAD+反應的位置。據報道，His147與Tyr158和Ser145一起作為催化三元體，啟動催化中繼機制，并最終導緻氫化物從葡萄糖的C1原子轉移到NAD+的煙酰胺部分，該煙酰胺部分位于活性位點中的葡萄糖下方。當H147突變為絲氨酸（圖5B）或異亮氨酸（圖5C）時，氫鍵丢失，與Trp152的π–π互相作用消失，這既削弱了與葡萄糖的互相作用，也可能導緻催化功能的喪失。H147S顯示出脫氫酶活性的完全消除，而H147I仍然充當脫氫酶，盡管程度遠低于Rd1bb。計算葡萄糖和蛋白質的界面得分以量化疏水互相作用。H147S突變體的界面得分相對于Rd1bb增加了1.43個羅塞塔能量機關（REU），這表明疏水互相作用減少，而葡萄糖與H147I突變體的界面分數幾乎與野生型（−0.15 REU）相同，這表明異亮氨酸的疏水接觸可能有助于将葡萄糖置于生産位置，并是以部分保持其脫氫酶活性。
為了進一步了解進化導緻的結構水準的變化，還用NAD+結合測定了Rd9bb酶的X射線晶體結構。Rd1bb與Rd9bb的疊加僅顯示出整體結構坐标的微小差異（rmsd為0.43Å）。除了電子密度存在明顯差異的兩個序列之間的突變外，在兩種蛋白質的活性位點幾乎沒有變化。突變體（I195G、K199R、F200W）中由殘基194至201組成的螺旋線的輕微移位可能有助于容納Rd9bb酶的較大底物。蛋白質的C末端密度較弱，是以尚不清楚這些蛋白質如何與底物互相作用。由于沒有得到與産物3a結合的Rd9bb的結構，作者進行了葡萄糖與Rd1bb的對接模拟，并使用SMINA程式給出了預測的最熱門姿勢（圖1和圖5）。對接的葡萄糖分子可能與Rd1bb活性位點中的各種殘基形成多個氫鍵。在這個姿勢中，葡萄糖的C1原子位于距離煙酰胺環3.5Å的位置，并且有可能向NAD+提供氫化物。