今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Enhancing the Imine Reductase Activity of a Promiscuous Glucose Dehydrogenase for Scalable Manufacturing of a Chiral Neprilysin Inhibitor Precursor”，通讯作者为美国Codexis公司的Xiang Yi。
葡萄糖脱氢酶（GDH）已被广泛用于从NAD(P)+回收NAD(P)H，同时将d-葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯。作为短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的原型成员，GDH被认为是一种高度底物特异性和单功能的酶。最近发现GDH（Rd1bb酶）可以作为环状亚胺盐不对称还原的催化剂。然而，Rd1bb酶和已知IRED的序列比对和结构比较显示几乎没有相似性。对GDH的混杂亚胺还原酶活性的理解显然是有限的，并且对环状亚胺盐以外的底物的反应性到目前为止还没有研究。
在本研究中，作者报道了偶然发现的GDH的亚胺还原酶活性。在最近的一个酶进化程序中，用(S)-丙氨酸乙酯（1a）还原胺化α-酮酸2a，以在奈普赖氨酸抑制剂的合成中获得中间体3a，奈普赖素抑制剂是治疗顽固性高血压的候选药物（方案1），观察到GDH酶不仅可以催化NAD(P)H的再循环，而且本身可以显示出IRED样活性，在还原胺化反应中起催化剂作用。使用最先进的CodeEvolver定向进化技术将GDH酶转化为IRED。最终的酶催化了所需的还原胺化反应，并达到了预定的效率和选择性目标。
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发现GDH Rd1bb的亚氨还原酶活性
作者在来源于固醇脱氢酶（ODHs）的Codexis IRED突变体上进行从非天然底物α-酮酸2a和(S)-丙氨酸乙酯（1a）合成所需产物3a的初始酶进化程序。将酶促反应与使用葡萄糖作为末端还原剂的GDH辅因子回收系统偶联，以实现IRED反应的高转化率（方案1）。GDH Rd1bb，一种来自枯草芽孢杆菌的工程化GDH，具有显著提高的热稳定性和葡萄糖脱氢酶活性，被用作辅因子回收系统。在不存在IRED酶的情况下，通过LC-MS分析检测到微量的产物信号。通过测试两种额外的辅因子回收系统，亚磷酸脱氢酶（PDH）和亚磷酸钠或单独的NADH，进一步测试了Rd1bb依赖性反应。在不含Rd1bb的反应中未检测到产物信号，证实Rd1bb确实在催化还原胺化反应。最后，在不含初始IRED酶的反应中测量Rd1bb的剂量反应，证实Rd1bb显示出IRED样反应性。
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GDH进化第一轮：GDH对IRED反应性的进化
与对不期望的(S,R)-产物表现出强烈偏好的IRED催化反应相比，Rd1bb的混杂亚胺还原酶活性对期望的(S,S)-非对映异构体表现出低但排他性的偏好。因此，在保持Rd1bb的高非对映选择性的同时提高活性是进化程序的目标。为了最大限度地提高筛选速度，在每一轮进化中使用对所需产物3a有选择性的高效RapidFire MS方法来筛选所有文库。为了确保产物3a的所需非对映选择性，通过LC-MS进一步验证所得突变体活性。
作者设计并构建了一个饱和诱变（SM）文库，靶向葡萄糖结合口袋周围的33个位置（图1），以37%的覆盖率产生大约400个突变体。在5当量胺1a的存在下，使用PDH和亚磷酸钠作为独立的NADH再循环系统，或者在没有额外的NADH循环系统的情况下使用浓度为6和20g/L的NAD+和葡萄糖，以1.25g/L的底物2a浓度进行筛选。后一种筛选设置假设了一些新产生的GDH突变体在与IRED同时起作用的同时保留了其氧化葡萄糖的能力。两种筛选策略都很成功。在高通量筛选（HTP）过程中，发现许多命中活性超过了起始的Rd1bb酶。
大多数有益突变的突变残基位于葡萄糖结合袋内，如L95A或V、E96A或C、H147I、S、a或Q、F155N或a和F256A、V、T、S、Q或L，或与NAD+密切接触，如A159C或T（图1）。值得注意的是，来自相邻单体的C末端环的F256有助于活性的提高。该位置的多种有益突变突出了其对IRED活性的关键影响。通常，向小和/或柔性残基的突变，这可能会增加结合口袋的大小，从而容纳更大的酮和胺底物。第一轮进化的结果证明GDH的亚胺还原酶活性可以提高。尽管总活性仍然很低，但多种突变体显示出显著的活性改善，对所需的(S,S)-非对映异构体保持>99%的非对映选择性。选择具有优异性能的H147I突变体作为第2轮突变模板。
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GDH进化第2-4轮：抑制酮还原
在最初的筛选过程中，α-酮酸2a底物的还原超过了所需的亚胺还原酶活性，形成了大量的醇副产物4（图2a）。醇的形成有三个来源：GDH酶、裂解物的未知背景反应性和NADH的直接化学还原。在第2轮试验验证阶段，通过将NAD+辅因子浓度从1.5 g/L降低到0.1 g/L（该浓度适合大规模生产），降低了NADH非催化还原的风险。确定的热点突变体Rd3bb的醇副产物量从50%降至约20%，该突变体被选为第3轮突变模板（图2A）。为了补偿降低的辅因子浓度并保持足够高的辅因子回收率，由于较高的周转率，从第3轮开始，Rd1bb和葡萄糖取代PDH和亚磷酸钠作为回收系统。
在第3轮和第4轮的筛选目标是同时活性增加和醇形成减少，以指导文库设计和命中率选择。通过绘制产物活性与醇副产物的倍数提高的曲线来分析HTP筛选数据，可以容易地识别具有优异化学选择性的命中物，这表现为产物与醇的比率增加，同时活性增加（图2B，C）。通过与模板序列（对于突变文库的命中）或MOSAIC（对于组合文库的命中）的直接比较，选择顶部命中（图2B，虚线上方）进一步进行了序列活性和序列化学选择性分析，MOSAIC是一种用于分别去卷积和预测突变对所需IRED活性和化学选择性的影响的软件。通过这项工作，鉴定出了有利于提高活性和提高化学选择性的突变（图2D，红色），并进一步用于构建下一轮组合文库。第3轮和第4轮最高命中分别为Rd4bb和Rd5bb，Rd4bb对醇的进一步抑制低至10%，Rd5bb完全消除了醇，而产品活性不断上升并占主导地位（图2A）。从第4轮开始，在筛选和验证反应中不再检测到作为副产物的醇4的形成。
值得注意的是，在Rd5bb（I147R）中鉴定的突变是第一轮进化过程中的关键突变（Rd1bb和H147I）的逆转，该突变消除了GDH的葡萄糖脱氢酶活性。His147与Tyr158和Ser145一起被认为构成了催化三元结构，负责通过中继机制促进从葡萄糖的C1原子到NAD+的烟酰胺部分的氢化物转移。推测147位的残基在GDH的催化酮还原酶功能中也起着关键作用。I147R突变导致GDH对底物2a无酮还原酶活性，并同时提高其对产物3a的亚胺还原酶活性。因此，在第5-8轮筛选中，任何携带该突变的文库变体都不太可能产生醇副产物4。
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GDH进化第5-8轮：用于规模制造的进一步改进
虽然在五轮进化中，所需活性和化学选择性已经取得了重大进展，但进化的GDH酶的亚胺还原酶活性还不足以大规模生产产品3a。在30°C、50 g/Lα-酮酸2a、5倍摩尔过量的(S)-丙氨酸乙酯（1a）、0.1 g/L NAD+、1 g/L Rd1bb和35 g/L d-葡萄糖的条件下，5 g/L酶负荷下的Rd5bb在15小时内仅实现约40%的转化。因此，在典型的制造条件下，特别是在更高浓度的底物2a和在升高的温度下减少过量的共底物胺1a的条件下，作者进行进一步的进化以优化性能，从而提高活性和反应速率（表1）。进化的GDH酶的IRED活性持续增加，直到最后一轮。在八轮进化中，筛选了20个文库和16000多个突变体，靶向99%的所有位置和60%的所有突变。在每一轮进化中，通过靶向酶的特定区域，通过位点饱和诱变文库引入新的多样性，并将通过HTP筛选鉴定的有益多样性重组到下一轮的组合文库中。组合文库的命中率通常显示出优于位点诱变文库的性能，证明经验证的有益多样性的积累以组合的方式提供了逐步的改进。
在进化过程中，GDH变得更加亲水，GDH的表达和溶解度也随之提高，特别是在第4轮和第5轮进化过程中，文库开始靶向表面位置。与起始的Rd1bb酶相比，最终突变体Rd9bb携带29个突变（图3A），累积活性提高约6.3×106（图3B）。
作者进一步研究了关键工艺参数对GDH突变体的亚胺还原酶活性的影响。包括pH值、NAD+相对于NADP+的辅因子偏好、α-酮酸2a和(S)-丙氨酸乙酯（1a）之间的化学计量、酶的热稳定性和反应温度。基于这些结果，使用(S)-丙氨酸乙酯（1a）作为相应的盐酸盐，用Rd6bb进行早期工艺开发。在最优条件下，在3小时内实现向目标产物3a的完全转化。通过HPLC以94%的分离产率和>99%的纯度提供产物3a，其为单一立体异构体，er为>99.9:0.1，dr为>99.9-0.1。
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葡萄糖脱氢酶的进化和调节混杂的IRED活性
对于任何混杂的酶，副反应，即GDH情况下的亚胺还原酶活性，相对于主要反应途径的天然催化活性是缓慢的。本研究表明，应用适当的诱变和筛选策略，可以将以前的混杂活性转化为未来的主要活性。除了起始的Rd1bb突变体外，当与葡萄糖作为底物和NAD+作为辅因子孵育时，进化模板没有显示出任何可测量的脱氢酶活性（图4A）。这一观察结果推断，GDH在葡萄糖结合位点成为靶点的第一轮进化过程中失去了脱氢酶活性。尽管葡萄糖结合位点的大多数突变对酶的IRED能力没有有益影响，但葡萄糖结合口袋中的三个残基E96、H147和F155的变化似乎是有影响的，IRED活性增加了2-4倍（图4B）。
此外，鉴定从GDH向IRED转变的关键残基的另一种方法是基于GDH回收辅因子NAD+的功能。在不存在辅因子回收系统的情况下表现出低IRED活性但在存在辅因子循环系统的情况中表现出良好活性的IRED突变体E96、H147和F155失去了天然GDH活性，H147A或H147S突变在消除脱氢酶活性和促进IRED活性方面的关键作用。F155N不影响Rd1bb对葡萄糖的氧化，可能是因为该位置远离葡萄糖氧化的催化位点（图1）。此外，突变F155N可能降低空间位阻和/或提供更多的电荷相互作用，导致酶对亚胺中间体的调节性提高，并伴随IRED活性增加。
作者解析了与NAD+结合的Rd1bb酶的晶体结构，并将其用作模板来对H147S和H147I突变体进行建模。使用SMINA对葡萄糖进行对接模拟，以进一步研究这些关键残基的结构和功能作用。在Rd1bb模型中，葡萄糖采用每个羟基与包括Tyr158、Glu96、Lys199、Asn196、His147和Ser145的相邻氨基酸形成氢键的构象。H147和葡萄糖的C6羟基之间形成氢键，His147本身也与Trp152形成π–π相互作用，可能进一步稳定His147的取向（图5A）。结果，葡萄糖被定向到与NAD+反应的位置。据报道，His147与Tyr158和Ser145一起作为催化三元体，启动催化中继机制，并最终导致氢化物从葡萄糖的C1原子转移到NAD+的烟酰胺部分，该烟酰胺部分位于活性位点中的葡萄糖下方。当H147突变为丝氨酸（图5B）或异亮氨酸（图5C）时，氢键丢失，与Trp152的π–π相互作用消失，这既削弱了与葡萄糖的相互作用，也可能导致催化功能的丧失。H147S显示出脱氢酶活性的完全消除，而H147I仍然充当脱氢酶，尽管程度远低于Rd1bb。计算葡萄糖和蛋白质的界面得分以量化疏水相互作用。H147S突变体的界面得分相对于Rd1bb增加了1.43个罗塞塔能量单位（REU），这表明疏水相互作用减少，而葡萄糖与H147I突变体的界面分数几乎与野生型（−0.15 REU）相同，这表明异亮氨酸的疏水接触可能有助于将葡萄糖置于生产位置，并因此部分保持其脱氢酶活性。
为了进一步了解进化导致的结构水平的变化，还用NAD+结合测定了Rd9bb酶的X射线晶体结构。Rd1bb与Rd9bb的叠加仅显示出整体结构坐标的微小差异（rmsd为0.43Å）。除了电子密度存在明显差异的两个序列之间的突变外，在两种蛋白质的活性位点几乎没有变化。突变体（I195G、K199R、F200W）中由残基194至201组成的螺旋线的轻微移位可能有助于容纳Rd9bb酶的较大底物。蛋白质的C末端密度较弱，因此尚不清楚这些蛋白质如何与底物相互作用。由于没有得到与产物3a结合的Rd9bb的结构，作者进行了葡萄糖与Rd1bb的对接模拟，并使用SMINA程序给出了预测的最热门姿势（图1和图5）。对接的葡萄糖分子可能与Rd1bb活性位点中的各种残基形成多个氢键。在这个姿势中，葡萄糖的C1原子位于距离烟酰胺环3.5Å的位置，并且有可能向NAD+提供氢化物。