今日推送的文章是發表在ChemBioChem上的“Synthesis of Pharmaceutically Relevant Arylamines Enabled by a Nitroreductase from Bacillus tequilensis”，通訊作者為格羅甯根大學的Gerrit J. Poelarends。
芳胺是制造有價值的藥物、顔料和染料的重要組成部分。然而，它們目前的工業生産涉及使用化學催化程式，會對環境産生重大影響。是以，黃素依賴性硝基還原酶（NR）作為更環保的芳胺合成的可持續催化劑受到越來越多的關注。在這項研究中，作者評估了一種來自特奎拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的新型 NR（名為 BtNR），用于合成藥學相關的芳胺，包括用于制造重磅藥物（如維莫德吉、索尼吉布、利奈唑胺和西地那非）的有價值的合成子。
結果與讨論
三種黃素酶是經過充分表征的 NR，據報道可以從硝基芳香族化合物開始進行胺合成，即來自恥垢分枝杆菌的 NfnB、來自奇異鍊黴菌的SNR和來自鞘氨醇 sp. 的 NfnB。此外，還選擇了來自 Bacillus tequilensis 的假定 NR，名為 BtNR。使用四種模型底物（1b、1c、1e 和 1g）評估純化酶的硝基還原酶活性，并通過 GC-MS 分析轉化為相應的胺産物（表 1）。硝基還原酶 BtNR 能夠令人滿意地轉化為所需的胺産物，其性能優于其他三種候選酶，是以被選擇用于進一步的底物範圍分析和反應優化。使用一組十三種硝基化合物對 BtNR 的底物範圍進行了分析，其中包括四種硝基芳烴，它們可産生重磅藥物維莫德吉、索尼吉布、利奈唑胺和西地那非的胺前體，以及具有制藥和工業價值的聯芳基化合物。
圖1
該酶對大體積硝基苯、硝基吡啶和硝基吡唑具有活性，具有中等至優異的胺産物轉化率（表 2）。值得注意的是，二硝基底物 1 g 和 1j 沒有觀察到區域選擇性，因為二胺化合物 2 g 和 2 j 主要是由少量部分還原的副産物形成的。在厭氧條件下，1 g（從 56% 到 92%）、1 k（從 60% 到 98%）和 1 l（從 2% 到 18%），胺的轉化率顯着增加。然而，對于底物 1 小時（從 64% 到 57%）和 1 j（從 84% 到 81%），沒有發現顯着差異。這些結果表明分子氧的存在确實會阻礙轉化為胺。BtNR 催化的需氧生物轉化導緻某些底物硝基還原降低，但其他底物則不然，這一觀察表明氧的負面影響可能與底物和中間體有關。
試了 BtNR 在各種共溶劑和不同溫度下的穩定性。我們選擇硝基化合物 1a 作為該分析的底物，因為它在水性緩沖液中的溶解度很差，是以優化其向胺 2a 的轉化十分重要（圖 2A）。值得注意的是，使用 20% DMSO 以及使用百分比為 10% 和 20% 的甲醇時，最終胺的轉化率幾乎增加了兩倍（圖 2A）。結果發現，最佳共溶劑是濃度為 20% 的 DMSO，但該酶在含有甲醇和異丙醇的水性緩沖液中也表現良好。胺産物的産率在 37 °C 時增加至 21%，這可能是由于底物溶解度增加，這表明在水中的低溶解度可能是化合物 1a 轉化的限制因素（圖 2A）。
圖2
使用硝基底物1a、1b、1c、1k、1l和1m進行生物轉化，并應用厭氧條件以盡量減少副産物的形成。使用 pH 7.0 0.1 M 磷酸鈉緩沖液中的 20 μM BtNR、100 mM 葡萄糖、1 mM NAD+ 和 4 μM GDH，含有 10 % DMSO（總共 10 mL），将半制備規模反應的底物濃度增加至 8 mM體積）。反應在室溫下進行（底物 1a 在 37°C 下）48 小時。使用快速色譜法純化酶法制備的産物，并通過 1H-NMR 和 HRMS 分析鑒定為相應的胺。通過 1 H NMR 确定胺産物的最終分離産率為産物 2a 6%、産物 2b 45%、産物 2c 56%、産物 2k 44%、産物 2l 18% 和 13産品 2 m 的 %。通過優化提取和純化程式，可以進一步提高收率。