今日推送的文章是发表在ChemBioChem上的“Synthesis of Pharmaceutically Relevant Arylamines Enabled by a Nitroreductase from Bacillus tequilensis”，通讯作者为格罗宁根大学的Gerrit J. Poelarends。
芳胺是制造有价值的药物、颜料和染料的重要组成部分。然而，它们目前的工业生产涉及使用化学催化程序，会对环境产生重大影响。因此，黄素依赖性硝基还原酶（NR）作为更环保的芳胺合成的可持续催化剂受到越来越多的关注。在这项研究中，作者评估了一种来自特奎拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的新型 NR（名为 BtNR），用于合成药学相关的芳胺，包括用于制造重磅药物（如维莫德吉、索尼吉布、利奈唑胺和西地那非）的有价值的合成子。
结果与讨论
三种黄素酶是经过充分表征的 NR，据报道可以从硝基芳香族化合物开始进行胺合成，即来自耻垢分枝杆菌的 NfnB、来自奇异链霉菌的SNR和来自鞘氨醇 sp. 的 NfnB。此外，还选择了来自 Bacillus tequilensis 的假定 NR，名为 BtNR。使用四种模型底物（1b、1c、1e 和 1g）评估纯化酶的硝基还原酶活性，并通过 GC-MS 分析转化为相应的胺产物（表 1）。硝基还原酶 BtNR 能够令人满意地转化为所需的胺产物，其性能优于其他三种候选酶，因此被选择用于进一步的底物范围分析和反应优化。使用一组十三种硝基化合物对 BtNR 的底物范围进行了分析，其中包括四种硝基芳烃，它们可产生重磅药物维莫德吉、索尼吉布、利奈唑胺和西地那非的胺前体，以及具有制药和工业价值的联芳基化合物。
图1
该酶对大体积硝基苯、硝基吡啶和硝基吡唑具有活性，具有中等至优异的胺产物转化率（表 2）。值得注意的是，二硝基底物 1 g 和 1j 没有观察到区域选择性，因为二胺化合物 2 g 和 2 j 主要是由少量部分还原的副产物形成的。在厌氧条件下，1 g（从 56% 到 92%）、1 k（从 60% 到 98%）和 1 l（从 2% 到 18%），胺的转化率显着增加。然而，对于底物 1 小时（从 64% 到 57%）和 1 j（从 84% 到 81%），没有发现显着差异。这些结果表明分子氧的存在确实会阻碍转化为胺。BtNR 催化的需氧生物转化导致某些底物硝基还原降低，但其他底物则不然，这一观察表明氧的负面影响可能与底物和中间体有关。
试了 BtNR 在各种共溶剂和不同温度下的稳定性。我们选择硝基化合物 1a 作为该分析的底物，因为它在水性缓冲液中的溶解度很差，因此优化其向胺 2a 的转化十分重要（图 2A）。值得注意的是，使用 20% DMSO 以及使用百分比为 10% 和 20% 的甲醇时，最终胺的转化率几乎增加了两倍（图 2A）。结果发现，最佳共溶剂是浓度为 20% 的 DMSO，但该酶在含有甲醇和异丙醇的水性缓冲液中也表现良好。胺产物的产率在 37 °C 时增加至 21%，这可能是由于底物溶解度增加，这表明在水中的低溶解度可能是化合物 1a 转化的限制因素（图 2A）。
图2
使用硝基底物1a、1b、1c、1k、1l和1m进行生物转化，并应用厌氧条件以尽量减少副产物的形成。使用 pH 7.0 0.1 M 磷酸钠缓冲液中的 20 μM BtNR、100 mM 葡萄糖、1 mM NAD+ 和 4 μM GDH，含有 10 % DMSO（总共 10 mL），将半制备规模反应的底物浓度增加至 8 mM体积）。反应在室温下进行（底物 1a 在 37°C 下）48 小时。使用快速色谱法纯化酶法制备的产物，并通过 1H-NMR 和 HRMS 分析鉴定为相应的胺。通过 1 H NMR 确定胺产物的最终分离产率为产物 2a 6%、产物 2b 45%、产物 2c 56%、产物 2k 44%、产物 2l 18% 和 13产品 2 m 的 %。通过优化提取和纯化程序，可以进一步提高收率。