引言
堿基編輯器（Base editor，BE）作為一種新興的靶向突變技術已經被廣泛用于微生物細胞進化、蛋白質工程、代謝工程以及合成生物學的其他方面研究。然而，微生物細胞中現存的BE通常具有狹窄的編輯視窗（5~7 nt），對應至多發生2~3個氨基酸的替換，這限制了BE在基因多樣化中的潛力。
2024年4月11日，江南大學周哲敏和韓來闖共同通訊在Advanced Science 發表題為“A New-Generation Base Editor with An Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering”的研究論文，該研究通過對CRISPR/Cas12b進行設計，創制出“新一代堿基編輯器”，實作微生物細胞（Bacillus subtilis和Escherichia coli）的高效且大範圍的堿基編輯。
值得注意的是，該“新一代堿基編輯器”在微生物細胞中的編輯視窗表現驚人，達到了42~64 nt，是目前微生物細胞中編輯視窗最寬的BE，最多實作8個以上氨基酸的替換，為微生物體内靶向突變以及合成生物學其他方面研究提供了重要的遺傳工具。
對于微生物底盤進化而言，突變通常需要發生在一個較大的編輯視窗内，通過疊代基因組編輯實作目标基因的多樣化進而産生大量的表型；結合有效的高通量篩選技術，加速底盤細胞的開發。然而，微生物細胞中現存的BE通常具有狹窄的編輯視窗（5~7 nt），對應至多發生2~3個氨基酸的替換，這限制了BE在基因多樣化中的潛力。盡管通過sgRNA的延長以及多類型脫氨酶的融合可以在一定程度上擴充BE的編輯視窗（周哲敏課題組前期工作，Hao et al. Nucleic Acids Res. 2021, 49(16): 9594-9605; Hao et al. Chem. Sci. 2022, 13: 14395-14409），但是其在靶标處的可編輯範圍依然有限。針對上述關鍵科學問題，本研究選擇Cas12b作為建構BE的候選Cas蛋白，由于其體積相較于Cas9、Cas12a更小，是以将其與脫氨酶進行連接配接可以避免Cas蛋白體積過大導緻的空間位阻對于脫氨酶可作用活性範圍的限制。首先在B. subtilis中涉及創制了基于CRISPR/Cas12b的基因編輯系統。接下來，基于序列比對、分子動力學模拟以及分子對接政策，發現了影響Cas12b DNA核酸酶活性的關鍵位點并首次建構了失活版本的dBhCas12b，并将其用于B. subtilis的基因表達調控中（CRISPRi）。本研究将改造的dBhCas12b與胞苷脫氨酶（PmCDA）進行聯用，分别設計建構了四個CBE體系。其中将CDA融合到dBhCas12b的N端并額外添加兩個拷貝的UGI的建構政策（CDA-dBhCas12b-UGI-UGI）能夠在B. subtilis中誘導C到T的突變且編輯視窗約為16 nt；此外将改造後的腺苷脫氨酶ABE8e融合到dBhCas12b的N端建構ABE體系，編輯實驗顯示該系統能夠高效誘導A到G的突變，且編輯視窗達到14 nt。進一步地，本研究還将新一代堿基編輯器應用于B. subtilis中RBS+Spacer的大視窗（15 nt）多樣化中，通過建構RS組合突變文庫，以最大程度調控基因的表達。為了測試新一代BE在其他微生物細胞中的普适性，本研究還在E. coli (JM109和BL21) 中建構了一個基于溫敏質粒的CBE體系進行驗證。群體和單克隆測序結果均發現，新一代CBE的編輯視窗高達41~63 nt，甚至超出了protospacer的長度（23 nt）。經全基因組測序（WGS）發現，dBhCas12b-CBE并沒有發生可檢測的脫靶效應，證明了該新一代BE系統是一個高精度的基因組編輯器，其編輯視窗是目前已報道BE的8~10倍，是迄今微生物系統中報道的編輯視窗最寬的BE。
新一代BE在E. coli中設計與功能驗證（Credit: Advanced Science）
原文連結
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38613787/
責編|探索君
排版|探索君
文章來源|“iNature”
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