大家好，今天推送的文章是2015年5月發表在 Acta crystallographica. Section D, Structural biology 上的 “Structural analysis of the a-glucosidase HaG provides new insights into substrate specificity and catalytic mechanism”，通訊作者為北海道大學先進生命科學學院的 姚闵 教授。
α-葡萄糖苷酶催化底物非還原端α-葡萄糖苷鍵的水解，對于α-葡萄糖苷的代謝很重要。鹽單胞菌屬H11 α-葡萄糖苷酶 (HaG) 屬于糖苷水解酶家族 13 (GH13)，在天然底物中僅對 α-(1→4) 連接配接的二糖麥芽糖具有高水解活性。盡管GH13成員的幾個三維結構已被解析，但由于缺乏相應的底物結合結構，α-葡萄糖苷酶的二糖特異性和 α-(1→4) 識别機制尚不清楚。
在本研究中，作者團隊解決了 HaG 的四種晶體結構：apo 形式、葡萄糖基-酶中間體複合物、與其天然底物麥芽糖複合的 E271Q 突變體以及 D202N 突變體與 D-葡萄糖和甘油的複合物，揭示了對α-葡萄糖苷酶的底物特異性和催化機制的新見解。
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HaG 的整體結構與活性位點
四種晶體結構均在不對稱單元中包含二聚體。與 GH13 家族成員類似，HaG 的結構由主催化結構域 A（殘基 1-106 和 175-465）、富含環的結構域 B（殘基 107-174）和由兩個反平行的β-折疊形成的高度保守的結構域 C（殘基466-538）（圖1a）。
結構域 A 是催化結構域，由經典的 TIM 桶形成，夾在結構域 B 和 C 之間。
結構域B含有1個α-螺旋和3個β-鍊，它從結構域 A 延伸并與結構域 A 一起形成催化口袋的壁。結構域 C 似乎穩定了整個結構的構象，但其功能仍不清楚。在HaG中，C域中有四個苯丙氨酸（Phe479、Phe492、Phe516和Phe534），它們都位于與A域接觸的表面，形成穩定整個結構的疏水界面。
HaG 的整體結構與 GH13 家族成員中來自嗜中酸假單胞菌 MX-45 的蔗糖異構酶 MutB（PDB ：2pwh）具有最高的相似性，均方根偏差為1.9 Å。雖然兩種酶活性位點口袋底部的子位點 -1 的結構相似，但子位點 +1不同（圖 1b）。此外， MutB 中的 Phe256 和 Phe280（MutB_Phe256 和 MutB_Phe280）在蔗糖異構酶中是保守的，并且對于控制分子内轉葡萄糖基化至關重要，但在HaG 中 MutB_Phe256、Gly273 的相應殘基不與底物互相作用。HaG 的 Phe297 對應于 MutB_Phe280，并且在 HaG-底物複合結構中距離底物更遠。這種結構特征可能反映在它們的轉糖基化特異性中。
HaG 的活性位點口袋由 15 個殘基組成。其中催化親核試劑Asp202、通用酸/堿催化劑Glu271、Asp333、Arg200、His105、His332、Phe297和Tyr65等8個殘基在GH13家族中是保守的。六個殘基 Asp62、Arg400、Phe166、Thr203、Phe206 和 Phe147 在 HaG 的同源物中保守，另一個殘基 Gly228 僅在 HaG 中發現。催化親核試劑（Asp202）和一般酸/堿催化劑（Glu271）之間的距離為 5.6Å，該現象在其他糖苷酶中保守。環（Leu201–Arg246）位于 HaG 催化 A 結構域的第四個 α-折疊和 α-螺旋（β→α loop 4）之間，比其他 GH13 成員中的更長（圖 1c），它位于子位點+1葡萄糖基部分的正上方，覆寫了活性位點入口的主要部分（圖1b）
上述活性位點的構象在四個結構中都非常相似（15個Cα原子的均方根誤差在0.21 Å 以内），這意味着該反應不需要HaG的結合殘基或反應殘基發生構象變化。表明 HaG 啟動催化反應所需的能量少于其他酶。
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葡萄糖基-HaG中間體結構
作者團隊為了獲得底物結合複合物，将普通酸/堿 Glu271 突變為無活性的 Gln271 (E271Q)。該殘基位于亞位點+1處，是以不影響亞位點-1處的底物結合。亞位點-1處的葡萄糖殘基被六個保守殘基固定在适當的位置：His105、Asp62、Arg200、Arg400、Asp333和His332（圖2b）。Asp62 和 Arg400 之間形成鹽橋，這對于非還原端葡萄糖殘基的識别很重要。作者團隊發現兩個殘基 Thr203 和 Phe297 與糖苷鍵識别相關。Thr203 被假設為連鎖特異性的重要殘基之一。α-(1→4)-特異性葡萄糖苷酶一般在該位置有Thr或Ala，而α-(1→6)特異性葡萄糖苷酶具有Val。E271Q-Mal 與來自釀酒酵母的異麥芽糖酶與異麥芽糖複合物的疊加（PDB：3axh）表明，由于來自 Val216 的空間位阻，麥芽糖的還原端不能與異麥芽糖酶的 +1 亞位點結合，而HaG的Thr203為麥芽糖和異麥芽糖留下了足夠的空間（圖3a）。
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相反，HaG 的 Phe297 可以阻礙異麥芽糖與 HaG 的結合，與麥芽糖結合。在異麥芽糖酶中，相同位置的苯丙氨酸（Phe303）采用與HaG中的Phe297不同的構象（圖3a），其通過與Phe206、Ile146和Phe166的疏水互相作用形成亞位點+1的内壁。另一個非保守殘基 Gly228 的 O 原子位于β→αloop 4的中間，與麥芽糖互相作用（圖2b）。在葡聚糖葡萄糖苷酶中，Lys275 和 Glu371 與 +1 子位點葡萄糖殘基的 O2 和 O3 原子形成氫鍵；然而在 HaG 中，隻有 Gly228 位于底物和酶之間氫鍵互相作用距離内的 +1 亞位點，它在底物結合中具有輔助功能，并且僅識别 α-麥芽糖。E271Q-Mal 和 MutB-蔗糖的疊加（PDB ：2pwe）表明麥芽糖和蔗糖之間 +1 子位點上的葡萄糖殘基明顯扭轉，導緻 Gly228 更接近麥芽糖而不是蔗糖（圖.3b)，這可能與對麥芽糖的選擇性活性有關，因為蔗糖是 HaG 的不良底物。由于空間限制 (2.6 Å)，Phe297 也可能導緻 HaG 對蔗糖的活性較低。
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D202N-Glc-Gol 複合物
HaG 晶體的衍射分辨率為 1.47 Å，是在蔗糖存在下生長的。Fo-Fc電子密度圖清楚地顯示，通過與Asp202互相作用，葡萄糖基部分被捕獲在子位點-1中（圖6），表明在該複雜結構中捕獲了反應中間态。GH13α-葡萄糖苷酶的葡萄糖基酶中間體已認證使用其滅活劑捕獲，并且通過使用通用酸/堿突變酶與底物類似物（例如環糊精糖基轉移酶）獲得了中間體的結構。
與用無活性突變酶和底物類似物獲得的這些結構相比，葡萄糖基-HaG結構強烈表明其天然形式形成了葡萄糖基-酶中間體。作者推測該中間體被困在晶體中的原因如下：（i）沒有單價陽離子時去糖基化的速率非常慢，（ii）蔗糖是一對于 HaG種不良底物，(iii) 結晶緩沖液在 pH 7.5 時不含單價陽離子，該值高于最适pH (6.5)。葡萄糖基環與E271Q-Mal中-1子位點的非還原端緊密固定在相同位置，并采用4C1椅式構象（圖6），與HaG相比，沒有觀察到明顯的構象變化。在E271Q-Mal結構中，葡萄糖基環的C1與Asp202的O之間的距離為3.1Å，這比葡萄糖基-HaG中間體中的距離長得多。這表明葡萄糖基環的 C2-C1-O5-C5 扭轉角被改變以實作催化反應。
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與一個葡萄糖分子和一個甘油分子複合的無活性D202N突變體結構（D202N-Glc-Gol）能夠研究所學生産α-D-葡萄糖基甘油的轉糖基化過程（αGG；圖7a），D202NGlc-Gol 複合物中蛋白質的構象與 HaG 的構象幾乎相同。葡萄糖占據子位點-1，而甘油出現在子位點+1（圖7b）。幾乎與E271Q-Mal結構中的相同。D202N-Glc-Gol中葡萄糖的C2-C1-O5-C5扭轉角為65.7°，這與葡糖基-HaG中間體中的葡糖基環的扭轉角相似。然而D202N-Glc-Gol 中的葡萄糖和葡萄糖基-HaG 中間體中的葡萄糖殘基之間存在小幅旋轉，因為兩個 C1 原子之間的距離為 0.9 Å（圖 7c），水解反應後葡萄糖基環将遠離催化位點。
圖7
在本研究中，作者團隊解決了 HaG 的四種晶體結構：apo 形式、葡萄糖基-酶中間體複合物、與其天然底物麥芽糖複合的 E271Q 突變體以及 D202N 突變體與 d-葡萄糖和甘油的複合物。這些結構明确地提供了對 HaG 的底物特異性和催化機制的見解。奇特的β→α loop 4存在于α-葡萄糖苷酶中的環4負責由于空間位阻而嚴格識别二糖。兩個殘基 Thr203 和 Phe297 在 Gly228 的輔助下被發現可确定亞位點 +1 處底物的糖苷鍵特異性。
文章資訊：
http://dx.doi.org/10.1107/S139900471500721X