今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Choose Your Own Adventure: A Comprehensive Database of Reactions Catalyzed by Cytochrome P450 BM3 Variants”，通訊作者為蒙特利爾大學生物化學與分子系Joelle N. Pelletier教授。
細胞色素P450BM3單加氧酶是一個廣泛研究的課題，許多研究人員通過對這種酶的進化産生了各種各樣的産物。然而，随着P450BM3突變體催化的化學反應越來越廣泛，P450BM3突變體文庫的資訊極大豐富，但這些資訊卻雜亂無章。作者建立了一個資料庫，該資料庫根據其催化反應對變體進行分類，并包括了底物的詳細資訊，以便于提供反應背景。同時，該資料庫可以幫助快速識别常見的類似底物，幫助不熟悉酶的研究人員識别酶工程的起點。對于那些積極參與P450BM3工程的人來說，該資料庫以及這篇綜述為了解、預測和識别P450BM3變異的屬性提供了一個強大的使用者友好平台，鼓勵了該酶的進一步工程設計。
作者的目标是根據各自的化學過程、底物性質或一般應用将反應分為有意義的類别。首先将P450BM3催化的化學反應分為五類:羟基化反應、環氧化反應、碳轉移反應、亞硝基轉移反應和其他反應。羟基化包括芳香族羟基化、藥物/類藥物羟基化、小烷基羟基化和大烷基羟基化。環氧化反應分為類似天然底物的烷基底物和典型的苯乙烯衍生物的芳香族底物。作者根據這一分類将P450BM3變體分為九類。來自羟基化和環氧化類别的代表性底物呈現于反應圖1中。來自碳基轉移、腈轉移和其他反應類别的相應底物和産物展示于反應圖2中。
圖 1 P450 BM催化羟基化和環氧化反應的代表性底物
作者收集了截至2023年7月出版的讨論P450BM3的出版物，超過600篇出版物P450BM3被确定，它們總共包含數千個變體。我們選擇隻包括相對于親本酶表現出改進的P450BM3變體。鑒于氨基酸替換的頻繁發生，親本酶通常是天然的P450BM3，但也可以是引入進一步突變的任何變體。改進後的P450BM3酶的潛在改進包括提高産物收率，改變對某些産物異構體或對映體的選擇性，或增強酶的穩定性。根據以上要求篩選出了大約400份出版物，報告了1500多種具有改進功能的不同變體，包括220多種單一變體，250多種雙重變體和140多種三重變體。這些變異中的每一個都比親本酶表現出增強，這意味着，在許多情況下，隻需要少量的修飾就可以增強P450BM3的催化能力。作者的目的是研究能夠進行廣泛反應的氨基酸位置和突變，提供隻有通過收集數百種變體到資料庫才能獲得的獨特視角。是以作者讨論了每個反應類别中可增強對常見底物性能的重複位置或突變。這将有助于目前未使用P450BM3的研究人員識别合适的變體或底物以開始他們的研究。作者檢查了突變發生的位置，而不考慮結果突變。通過确定各種反應類别中發生頻繁突變的區域，可以确定發生突變時導緻反應混亂的位置。這些位置可以作為建立能夠催化多種反應的SSM庫的起點。
P450BM3血紅素結構域的晶體結構(殘基1−471,PDB:1FAG)突出了關鍵的二級結構元素:B'-螺旋(殘基72−83)、e-螺旋(殘基142−159)、f-螺旋(殘基171−190)、大部分暴露于溶劑的g-螺旋(殘基197−226)和i-螺旋。這些元素聚集在血紅素平面上方。青色的I-helix和紅色血紅素将作為所有圖中活性位點的方向參考點。
圖 2 P450BM3血紅素結構域(PDB:1FAG)的晶體結構
圖2描述了血紅素鐵和軸向半胱氨酸(Cys400)之間的互相作用。底物通道中含有共結晶的底物月桂酸，深藍色突出顯示，與上面展示的聚類關鍵元素相鄰。B'-螺旋、f-螺旋和I-helix在底物通路中有許多殘基與底物互相作用(圖2)。是以，P450BM3上大多數常見突變位點都位于這些區域。
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P450BM3變體催化芳香羟基化
作者确定了140個位點，在這些位點中，至少有一個突變提高了對芳香族羟基化的反應性(圖2)。47、51、74、78、82、87、188、263、328、330和353位點的突變經常與芳香底物羟基化改善相關，每個位點的多次引用證明了這一點。底物的完整清單見補充表2。這些位置大多數靠近底物通道，包括B'-螺旋、f-螺旋和i-螺旋。這一趨勢在整個審查過程中都很明顯。這些位置的SSM庫對于篩選不同的底物類别是非常價的。事實上，芳香羟基化反應包含400多個變體，其中一半隻包含一到兩個突變。由于對于這類反應，很少有突變較多的變異體的報道，這意味着很少的突變就足以産生操作有效的變異體。
圖 3 P450BM3血紅素結構域的所有位置-已經突變并顯示芳香羟基化的改善（紅色球體）
芳香族羟基化和藥物/類藥物羟基化反應類别表現出相似的突變模式。在藥物/類藥物羟基化分類中，據報道129個突變位點與親本酶相比有改善(圖4)。這些位點分布于整個血紅素結構域及其他區域，活性位點内有許多經常突變的位點。這表明了與芳香族羟基化相似的趨勢。47、51、64、72、74、78、81、82、86、87、143、188、267、319和415位點的突變頻繁發生，并與各種藥物和藥物樣底物的代謝有關。與芳香族羟基化相似，大多數經常發生突變的位點位于B'-螺旋、f-螺旋或i-螺旋上。
圖 4 圖中顯示了P450BM3血紅素結構域發生突變并向藥物/類藥物羟基化方向改善的所有位置(橙色球體)
對于藥物/類藥物羟基化類，資料庫中有400多種變體。其中，9%為單變異體，17%為雙變異體，11%為三變異體，其他變異體包含多達29個突變.考慮到這些底物與天然底物不相似，可能需要多個突變來實作理想的活性增強。
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P450BM3變體催化芳香環氧化
環氧化反應可基于底物是否類似于天然底物來分類。在資料庫中，最小的類别是芳香族環氧化，它僅包括34種獨特變異體，這些變異體在血紅素結構域的49個位點上都有突變。野生型P450BM3催化苯乙烯通過環氧化反應生成氧化苯乙烯，傾向于生成(R)-氧化苯乙烯，轉化率僅為14%，對映體過量為20%。引入F87G取代增強(R)-苯乙烯氧化物形成對映體過量高達90%。17,18變體139-3是改進小烷基羟基化的工程産物:其反應轉化率提高至40%，但對映體過量僅為6%。
圖 5 P450BM3血紅素結構域發生突變并向大烷基羟基化方向改善的所有位置均顯示(淺綠色球體)
第二組環氧化反應涉及的底物與BM3天然偏好的脂肪酸底物非常相似。據報道，在血紅素結構域内，隻有38個位點可提高突變後的活性。這是任何一類反應中突變位點的最少數量。這一類别中近50%的變異包括點替換，這表明在有限數量的位置上，少數突變可導緻功能改善。在這種類型的反應中，野生型酶經常對多種底物表現出顯著的活性。由于點取代變異體的效率很高，是以沒有什麼動力引入進一步的突變。是以，突變通常增強環氧化反應的區域或對映體選擇性，而不是産物的數量。此外，在底物環氧化和羟基化之間經常發生競争，其中利用P450BM3突變可以促進增加
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P450BM3變體催化二氧化碳轉移
由P450BM3變體催化的碳轉移反應代表了一種新穎的自然反應，并說明了酶工程如何産生創新功能。雖然268位和400位的突變在很大程度上負責解鎖這種反應性，但它與天然反應有很大不同，通常需要大量突變才能達到适度水準活性。碳烯轉移反應類别中，45個位點有159種不同的變異體(圖7)。與用于羟基化或環氧化反應的變異體相比，用于實施具有操作效用的碳烯轉移反應的變異體通常包含更多的突變。碳烯轉移反應類别的特征是攜帶18種突變的變異體的發生率，超過85%的變異體包含至少13種突變。
圖 7 所有P450BM3血紅素結構域發生突變并對碳烯轉移表現出改善的位置都顯示在圖中(深藍色球體)
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P450BM3發生重要或頻繁的突變
在所有反應類别中，選擇突變的位置存在廣泛的差異，進而導緻改進的P450BM3變體。根據該資料庫，很明顯大多數突變已經産生在底物通路或活性位點内或附近，但也很清楚，即使遠離血紅素，P450BM3的突變也能增強功能。替換頻率最高的25個位置是87、47、353、78、188、184、328、236、252、175、290、82、51、226、142、267、263、366、268、74、442、330、255、400和401.總體而言，突變覆寫率≥7的27個位置是位置47、49、51、72、74、75、78、81、82、87、88、181、184、185、188、260、263、267、268、327、328、329、330、354、436、437和438。其中，資料庫中突變覆寫率≥7的位置最多的是47、51、74、78、81、82、87、184、188、263、267、268、328和330。頻繁報道的高突變覆寫率的位點具有很高的意義，因為它們提供了豐富的資料，并證明了多種替換比天然氨基酸更有優勢。這些位點也經常是建立SSM文庫的目标，然後将最成功的變異體進行組合，産生高度活性和/或選擇性酶。
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自然進化與蛋白質工程中的氨基酸變異性
在确定了P450BM3的實驗方法導緻有益的高突變覆寫或頻繁突變的位置後，作者研究了蛋白質工程中的氨基酸變異性與自然進化的比較。作者确定了P450BM3和ConSurf相關同源物之間的保守殘基或區域。作者觀察到，P450BM3及其自然進化的同源物中的許多保守區域都位于底物通路和活性位點。這些區域的顯著保守是由于大多數p450天生通過C-H激活進行氧化反應，是以血紅素附近的區域通常是疏水的。作為天然催化功能的必需殘基，T268和C400在自然界中也是高度保守的。盡管如此，表面暴露的殘基(包括底物進入通道入口點周圍的殘基)的氨基酸特性存在相當大的可變性，這可能反映了P450同源物的天然底物的可變性。
為了比較自然進化和蛋白質工程之間的突變模式趨勢，作者根據其自然保守程度，重點關注上文描述和下文強調的突變覆寫率≥7的27個位點（圖）。 這些位點的突變會産生比親本酶活性更高的變異體。分析自然進化和蛋白質工程之間的突變模式立即揭示了一個重要的見解。具體而言，研究人員在進行突變時，不一定要避免氨基酸高度保守的位置，因為我們的資料庫顯示，突變覆寫率≥7的位置在自然界中通常是保守的(紅色球體)。在自然進化的P450BM3同源物中，高度保守的氨基酸可能具有催化關鍵作用或有助于底物結合穩定。然而，如果所關注的底物或反應與天然反應不同，可能需要突變這些保守區域，以創造一個更合适的底物結合環境。是以，在蛋白質工程中，自然界中高度保守的氨基酸往往會發生突變，以催化非天然反應，被證明是高度有益的突變。
圖 8 P450BM3血紅素結構域(PDB:1FAG)的晶體結構，27個氨基酸位置（彩色球體）突變覆寫率為7或更大。