今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Choose Your Own Adventure: A Comprehensive Database of Reactions Catalyzed by Cytochrome P450 BM3 Variants”，通讯作者为蒙特利尔大学生物化学与分子系Joelle N. Pelletier教授。
细胞色素P450BM3单加氧酶是一个广泛研究的课题，许多研究人员通过对这种酶的进化产生了各种各样的产物。然而，随着P450BM3突变体催化的化学反应越来越广泛，P450BM3突变体文库的信息极大丰富，但这些信息却杂乱无章。作者建立了一个数据库，该数据库根据其催化反应对变体进行分类，并包括了底物的详细信息，以便于提供反应背景。同时，该数据库可以帮助快速识别常见的类似底物，帮助不熟悉酶的研究人员识别酶工程的起点。对于那些积极参与P450BM3工程的人来说，该数据库以及这篇综述为理解、预测和识别P450BM3变异的属性提供了一个强大的用户友好平台，鼓励了该酶的进一步工程设计。
作者的目标是根据各自的化学过程、底物性质或一般应用将反应分为有意义的类别。首先将P450BM3催化的化学反应分为五类:羟基化反应、环氧化反应、碳转移反应、亚硝基转移反应和其他反应。羟基化包括芳香族羟基化、药物/类药物羟基化、小烷基羟基化和大烷基羟基化。环氧化反应分为类似天然底物的烷基底物和典型的苯乙烯衍生物的芳香族底物。作者根据这一分类将P450BM3变体分为九类。来自羟基化和环氧化类别的代表性底物呈现于反应图1中。来自碳基转移、腈转移和其他反应类别的相应底物和产物展示于反应图2中。
图 1 P450 BM催化羟基化和环氧化反应的代表性底物
作者收集了截至2023年7月出版的讨论P450BM3的出版物，超过600篇出版物P450BM3被确定，它们总共包含数千个变体。我们选择只包括相对于亲本酶表现出改进的P450BM3变体。鉴于氨基酸替换的频繁发生，亲本酶通常是天然的P450BM3，但也可以是引入进一步突变的任何变体。改进后的P450BM3酶的潜在改进包括提高产物收率，改变对某些产物异构体或对映体的选择性，或增强酶的稳定性。根据以上要求筛选出了大约400份出版物，报告了1500多种具有改进功能的不同变体，包括220多种单一变体，250多种双重变体和140多种三重变体。这些变异中的每一个都比亲本酶表现出增强，这意味着，在许多情况下，只需要少量的修饰就可以增强P450BM3的催化能力。作者的目的是研究能够进行广泛反应的氨基酸位置和突变，提供只有通过收集数百种变体到数据库才能获得的独特视角。因此作者讨论了每个反应类别中可增强对常见底物性能的重复位置或突变。这将有助于目前未使用P450BM3的研究人员识别合适的变体或底物以开始他们的研究。作者检查了突变发生的位置，而不考虑结果突变。通过确定各种反应类别中发生频繁突变的区域，可以确定发生突变时导致反应混乱的位置。这些位置可以作为创建能够催化多种反应的SSM库的起点。
P450BM3血红素结构域的晶体结构(残基1−471,PDB:1FAG)突出了关键的二级结构元素:B'-螺旋(残基72−83)、e-螺旋(残基142−159)、f-螺旋(残基171−190)、大部分暴露于溶剂的g-螺旋(残基197−226)和i-螺旋。这些元素聚集在血红素平面上方。青色的I-helix和红色血红素将作为所有图中活性位点的方向参考点。
图 2 P450BM3血红素结构域(PDB:1FAG)的晶体结构
图2描述了血红素铁和轴向半胱氨酸(Cys400)之间的相互作用。底物通道中含有共结晶的底物月桂酸，深蓝色突出显示，与上面展示的聚类关键元素相邻。B'-螺旋、f-螺旋和I-helix在底物通路中有许多残基与底物相互作用(图2)。因此，P450BM3上大多数常见突变位点都位于这些区域。
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P450BM3变体催化芳香羟基化
作者确定了140个位点，在这些位点中，至少有一个突变提高了对芳香族羟基化的反应性(图2)。47、51、74、78、82、87、188、263、328、330和353位点的突变经常与芳香底物羟基化改善相关，每个位点的多次引用证明了这一点。底物的完整列表见补充表2。这些位置大多数靠近底物通道，包括B'-螺旋、f-螺旋和i-螺旋。这一趋势在整个审查过程中都很明显。这些位置的SSM库对于筛选不同的底物类别是非常价的。事实上，芳香羟基化反应包含400多个变体，其中一半只包含一到两个突变。由于对于这类反应，很少有突变较多的变异体的报道，这意味着很少的突变就足以产生操作有效的变异体。
图 3 P450BM3血红素结构域的所有位置-已经突变并显示芳香羟基化的改善（红色球体）
芳香族羟基化和药物/类药物羟基化反应类别表现出相似的突变模式。在药物/类药物羟基化分类中，据报道129个突变位点与亲本酶相比有改善(图4)。这些位点分布于整个血红素结构域及其他区域，活性位点内有许多经常突变的位点。这表明了与芳香族羟基化相似的趋势。47、51、64、72、74、78、81、82、86、87、143、188、267、319和415位点的突变频繁发生，并与各种药物和药物样底物的代谢有关。与芳香族羟基化相似，大多数经常发生突变的位点位于B'-螺旋、f-螺旋或i-螺旋上。
图 4 图中显示了P450BM3血红素结构域发生突变并向药物/类药物羟基化方向改善的所有位置(橙色球体)
对于药物/类药物羟基化类，数据库中有400多种变体。其中，9%为单变异体，17%为双变异体，11%为三变异体，其他变异体包含多达29个突变.考虑到这些底物与天然底物不相似，可能需要多个突变来实现理想的活性增强。
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P450BM3变体催化芳香环氧化
环氧化反应可基于底物是否类似于天然底物来分类。在数据库中，最小的类别是芳香族环氧化，它仅包括34种独特变异体，这些变异体在血红素结构域的49个位点上都有突变。野生型P450BM3催化苯乙烯通过环氧化反应生成氧化苯乙烯，倾向于生成(R)-氧化苯乙烯，转化率仅为14%，对映体过量为20%。引入F87G取代增强(R)-苯乙烯氧化物形成对映体过量高达90%。17,18变体139-3是改进小烷基羟基化的工程产物:其反应转化率提高至40%，但对映体过量仅为6%。
图 5 P450BM3血红素结构域发生突变并向大烷基羟基化方向改善的所有位置均显示(浅绿色球体)
第二组环氧化反应涉及的底物与BM3天然偏好的脂肪酸底物非常相似。据报道，在血红素结构域内，只有38个位点可提高突变后的活性。这是任何一类反应中突变位点的最少数量。这一类别中近50%的变异包括点替换，这表明在有限数量的位置上，少数突变可导致功能改善。在这种类型的反应中，野生型酶经常对多种底物表现出显著的活性。由于点取代变异体的效率很高，因此没有什么动力引入进一步的突变。因此，突变通常增强环氧化反应的区域或对映体选择性，而不是产物的数量。此外，在底物环氧化和羟基化之间经常发生竞争，其中利用P450BM3突变可以促进增加
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P450BM3变体催化二氧化碳转移
由P450BM3变体催化的碳转移反应代表了一种新颖的自然反应，并说明了酶工程如何产生创新功能。虽然268位和400位的突变在很大程度上负责解锁这种反应性，但它与天然反应有很大不同，通常需要大量突变才能达到适度水平活性。碳烯转移反应类别中，45个位点有159种不同的变异体(图7)。与用于羟基化或环氧化反应的变异体相比，用于实施具有操作效用的碳烯转移反应的变异体通常包含更多的突变。碳烯转移反应类别的特征是携带18种突变的变异体的发生率，超过85%的变异体包含至少13种突变。
图 7 所有P450BM3血红素结构域发生突变并对碳烯转移表现出改善的位置都显示在图中(深蓝色球体)
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P450BM3发生重要或频繁的突变
在所有反应类别中，选择突变的位置存在广泛的差异，从而导致改进的P450BM3变体。根据该数据库，很明显大多数突变已经产生在底物通路或活性位点内或附近，但也很清楚，即使远离血红素，P450BM3的突变也能增强功能。替换频率最高的25个位置是87、47、353、78、188、184、328、236、252、175、290、82、51、226、142、267、263、366、268、74、442、330、255、400和401.总体而言，突变覆盖率≥7的27个位置是位置47、49、51、72、74、75、78、81、82、87、88、181、184、185、188、260、263、267、268、327、328、329、330、354、436、437和438。其中，数据库中突变覆盖率≥7的位置最多的是47、51、74、78、81、82、87、184、188、263、267、268、328和330。频繁报道的高突变覆盖率的位点具有很高的意义，因为它们提供了丰富的数据，并证明了多种替换比天然氨基酸更有优势。这些位点也经常是创建SSM文库的目标，然后将最成功的变异体进行组合，产生高度活性和/或选择性酶。
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自然进化与蛋白质工程中的氨基酸变异性
在确定了P450BM3的实验方法导致有益的高突变覆盖或频繁突变的位置后，作者研究了蛋白质工程中的氨基酸变异性与自然进化的比较。作者确定了P450BM3和ConSurf相关同源物之间的保守残基或区域。作者观察到，P450BM3及其自然进化的同源物中的许多保守区域都位于底物通路和活性位点。这些区域的显著保守是由于大多数p450天生通过C-H激活进行氧化反应，因此血红素附近的区域通常是疏水的。作为天然催化功能的必需残基，T268和C400在自然界中也是高度保守的。尽管如此，表面暴露的残基(包括底物进入通道入口点周围的残基)的氨基酸特性存在相当大的可变性，这可能反映了P450同源物的天然底物的可变性。
为了比较自然进化和蛋白质工程之间的突变模式趋势，作者根据其自然保守程度，重点关注上文描述和下文强调的突变覆盖率≥7的27个位点（图）。 这些位点的突变会产生比亲本酶活性更高的变异体。分析自然进化和蛋白质工程之间的突变模式立即揭示了一个重要的见解。具体而言，研究人员在进行突变时，不一定要避免氨基酸高度保守的位置，因为我们的数据库显示，突变覆盖率≥7的位置在自然界中通常是保守的(红色球体)。在自然进化的P450BM3同源物中，高度保守的氨基酸可能具有催化关键作用或有助于底物结合稳定。然而，如果所关注的底物或反应与天然反应不同，可能需要突变这些保守区域，以创造一个更合适的底物结合环境。因此，在蛋白质工程中，自然界中高度保守的氨基酸往往会发生突变，以催化非天然反应，被证明是高度有益的突变。
图 8 P450BM3血红素结构域(PDB:1FAG)的晶体结构，27个氨基酸位置（彩色球体）突变覆盖率为7或更大。