今天推送的文章是發表在Science上的 “Directed evolution of enzymatic silicon-carbon bondcleavage in siloxanes”,通訊作者是來自加州理工學院化學與化學工程系的Frances H. Arnold教授和Dow Silicones Corporation（陶氏有機矽有限公司）的Dimitris E. Katsoulis研究員。
線性和環狀揮發性甲基矽氧烷（VMS）是一種人為化合物，具有高骨架柔性和低表面張力等材料特性，可用于許多消費者應用，從洗滌劑和消泡劑到乳液、洗髮乳和護發素（圖1）。環狀VMS也是合成有機矽聚合物的重要原料。為了滿足消費者和原料對矽氧烷的需求，VMS的産量約為每年百萬噸。然而，VMS的社會效益必須與其潛在的環境污染、生物累積和毒性相平衡。考慮到VMS的普遍性、實用性和潛在問題，通過Si-C鍵斷裂降解VMS具有重要意義。
由于其高熱穩定性和缺乏功能性基團，VMS的降解是很難的。Si-O鍵的水解僅導緻物質形成，生成矽烷醇和矽氧烷二醇，而完全降解需要裂解相對惰性的Si-C鍵。實作VMS降解的化學手段僅限于幾個例子，包括TiO2光催化、熱解和羟基自由基在大氣中氧化。通常，這些Si-C鍵裂解反應是由矽氧烷甲基的一次或多次氧化引起的。在高等生物中的研究發現，VMS被代謝成一系列産物，包括訓示Si-C裂解的代謝物，這被認為是在C-H羟基化事件後發生的。酶促氧化可以解鎖一種适應各種環境和工藝條件的Si-C鍵裂解機制。然而，目前還沒有發現能夠羟基化矽氧烷C-H鍵或促進Si-C鍵斷裂的酶。作者假設細胞色素P450可以氧化未活化的烷基C-H鍵，也可以氧化同樣強的矽氧烷C-H鍵。是以，本文探索了這些酶作為酶催化Si-C鍵切割的起點的潛力。
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矽氧烷Si–C鍵斷裂活性的發現和定向演化
細胞色素P450BM3是一種由血紅素結構域與NADPH依賴的還原酶結構域融合而成的自足酶。這種可溶性細菌酶經過改造，可催化多種非天然的羟基化。為了檢驗酶促C-H羟基化可促進Si-C鍵斷裂這一假設，作者評估了一系列細胞色素P450BM3變異體氧化六甲基二矽氧烷中矽氧烷C-H鍵的能力。其中，一個之前未發表的P450BM3變體進化為矽烷和矽氧烷Si-H羟基化，命名為LSilOx1(線性矽氧烷氧化酶，第1代)，被選擇作為Si-C鍵裂解活性進化的起點(圖2A)。相對于野生型P450BM3, LSilOx1有13個氨基酸替換，野生型P450BM3不具有矽氧烷羟基化或Si-C鍵斷裂的活性。
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經過幾輪定向進化，Si–C鍵切割活性增強，其中活性定義為矽烷醇5濃度與酶濃度的比值（圖2A）。為了将酶促VMS Si–C鍵切割的範圍擴大到更複雜的底物，作者還研究了線性矽氧烷2。對LSilOx4進行随機誘變，并在玻璃96孔闆中進行酶促反應，進而能夠鑒定改進的變體LSilOx5（圖2B）。變體LSilOx5也對環狀矽氧烷3表現出活性，是以作為定向進化的合适起點（圖2C）。作為線性和環狀矽氧烷代表的矽氧烷2和3的進化導緻了LSilOx和CSilOx（環狀矽氧烷氧化酶）變體的不同譜系，證明了增強不同支架的Si–C鍵切割活性的能力。三種最終變體，LSilOx4、LSilOx7和CSilOx3，當配制成凍幹裂解物時，保留了50%以上的活性。而野生型酶對矽氧烷1-3沒有活性。這些資料表明，酶可以在溫和的條件下切割Si–C鍵—這種活性在任何先前報道的化學催化劑中都是不可能的，在酶中也沒有報道。盡管目前總體Si–C鍵切割活性适中，但這表明在這種非天然基質上的生物活性是可能的，而且可以增強。對這種活性的普遍性進行進一步的工程和研究将産生更強大的矽氧烷降解生物催化劑。目前的活性水準也使人們能夠研究Si–C鍵斷裂的機制。
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酶促Si–C鍵斷裂的性質
使用矽氧烷1和羟甘醇4作為模型系統，進行了一系列實驗，以探究Si–C鍵斷裂的機制。使用純化的LSilOx4，作者确定羟甘醇4到矽烷醇5的酶促轉化是NADPH依賴性的（圖3A）和氧依賴性的。這表明Fe-血紅素的氧化參與了Si–C鍵的切割。LSilOx4的FAD結構域的去除導緻變體LSilOx4ΔFAD的Si–C鍵切割活性損失2.6倍（圖3B）。這些結果與Si–C鍵斷裂中酶促氧化的參與一緻。随後作者将注意力轉向揭示裂解的甲基的命運。作者使用ABTS和purpald比色法，分别檢測甲醇和甲醛。結果顯示甲醛作為酶促反應的副産物。圖3D顯示了與羟甘醇4的酶反應時間過程，作者假設有痕量的GC-MS峰是甲酰矽氧烷10(圖4)。為了研究這種可能性，作者對羟甘醇4進行了Swern氧化，進而通過1H - 29si異核多鍵相關(HMBC)和質子核磁共振(1H NMR)原位合成和表征了甲酰基矽氧烷10。随後作者在乙酸乙酯萃取5分鐘後，獲得了與羟甘醇4酶促反應産生的甲酰矽氧烷10的高分辨率質譜資料。有了這一證據，可以推測初始的矽氧烷1的C-H羟基化之後，第二次氧化為甲酰矽氧烷10，後者轉化為矽烷醇5，表面上是通過[1,2]-Brook重排和水解(圖4C)。綜上所述，矽氧烷甲基的串聯氧化解鎖了VMS中Si-C鍵的酶解機制，并作為未來生物降解努力的一個進入途徑。
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圖4
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解鎖自然界中未知的退化活動
大量的定向進化文獻表明，即使是微量活性也可以被放大，進而産生強大的生物催化劑，用于生物界尚不清楚的轉化，包括鍛造和破壞Si–C鍵的酶。本文報道的酶催化的矽氧烷Si–C鍵的斷裂是原理的證明，代表了目前不被認為可生物降解的矽氧烷生物降解的第一步。立法似乎已經限制了VMS的使用，包括作者證明具有活性的八甲基環四矽氧烷。通過改造能夠切割Si-C鍵的酶，作者朝着VMS的最終生物降解邁出了關鍵一步。