今天推送的文章是发表在Science上的 “Directed evolution of enzymatic silicon-carbon bondcleavage in siloxanes”,通讯作者是来自加州理工学院化学与化学工程系的Frances H. Arnold教授和Dow Silicones Corporation（陶氏有机硅有限公司）的Dimitris E. Katsoulis研究员。
线性和环状挥发性甲基硅氧烷（VMS）是一种人为化合物，具有高骨架柔性和低表面张力等材料特性，可用于许多消费者应用，从洗涤剂和消泡剂到乳液、洗发水和护发素（图1）。环状VMS也是合成有机硅聚合物的重要原料。为了满足消费者和原料对硅氧烷的需求，VMS的产量约为每年百万吨。然而，VMS的社会效益必须与其潜在的环境污染、生物累积和毒性相平衡。考虑到VMS的普遍性、实用性和潜在问题，通过Si-C键断裂降解VMS具有重要意义。
由于其高热稳定性和缺乏功能性基团，VMS的降解是很难的。Si-O键的水解仅导致物质形成，生成硅烷醇和硅氧烷二醇，而完全降解需要裂解相对惰性的Si-C键。实现VMS降解的化学手段仅限于几个例子，包括TiO2光催化、热解和羟基自由基在大气中氧化。通常，这些Si-C键裂解反应是由硅氧烷甲基的一次或多次氧化引起的。在高等生物中的研究发现，VMS被代谢成一系列产物，包括指示Si-C裂解的代谢物，这被认为是在C-H羟基化事件后发生的。酶促氧化可以解锁一种适应各种环境和工艺条件的Si-C键裂解机制。然而，目前还没有发现能够羟基化硅氧烷C-H键或促进Si-C键断裂的酶。作者假设细胞色素P450可以氧化未活化的烷基C-H键，也可以氧化同样强的硅氧烷C-H键。因此，本文探索了这些酶作为酶催化Si-C键切割的起点的潜力。
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硅氧烷Si–C键断裂活性的发现和定向演化
细胞色素P450BM3是一种由血红素结构域与NADPH依赖的还原酶结构域融合而成的自足酶。这种可溶性细菌酶经过改造，可催化多种非天然的羟基化。为了检验酶促C-H羟基化可促进Si-C键断裂这一假设，作者评估了一系列细胞色素P450BM3变异体氧化六甲基二硅氧烷中硅氧烷C-H键的能力。其中，一个之前未发表的P450BM3变体进化为硅烷和硅氧烷Si-H羟基化，命名为LSilOx1(线性硅氧烷氧化酶，第1代)，被选择作为Si-C键裂解活性进化的起点(图2A)。相对于野生型P450BM3, LSilOx1有13个氨基酸替换，野生型P450BM3不具有硅氧烷羟基化或Si-C键断裂的活性。
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经过几轮定向进化，Si–C键切割活性增强，其中活性定义为硅烷醇5浓度与酶浓度的比值（图2A）。为了将酶促VMS Si–C键切割的范围扩大到更复杂的底物，作者还研究了线性硅氧烷2。对LSilOx4进行随机诱变，并在玻璃96孔板中进行酶促反应，从而能够鉴定改进的变体LSilOx5（图2B）。变体LSilOx5也对环状硅氧烷3表现出活性，因此作为定向进化的合适起点（图2C）。作为线性和环状硅氧烷代表的硅氧烷2和3的进化导致了LSilOx和CSilOx（环状硅氧烷氧化酶）变体的不同谱系，证明了增强不同支架的Si–C键切割活性的能力。三种最终变体，LSilOx4、LSilOx7和CSilOx3，当配制成冻干裂解物时，保留了50%以上的活性。而野生型酶对硅氧烷1-3没有活性。这些数据表明，酶可以在温和的条件下切割Si–C键—这种活性在任何先前报道的化学催化剂中都是不可能的，在酶中也没有报道。尽管目前总体Si–C键切割活性适中，但这表明在这种非天然基质上的生物活性是可能的，而且可以增强。对这种活性的普遍性进行进一步的工程和研究将产生更强大的硅氧烷降解生物催化剂。目前的活性水平也使人们能够研究Si–C键断裂的机制。
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酶促Si–C键断裂的性质
使用硅氧烷1和羟甘醇4作为模型系统，进行了一系列实验，以探究Si–C键断裂的机制。使用纯化的LSilOx4，作者确定羟甘醇4到硅烷醇5的酶促转化是NADPH依赖性的（图3A）和氧依赖性的。这表明Fe-血红素的氧化参与了Si–C键的切割。LSilOx4的FAD结构域的去除导致变体LSilOx4ΔFAD的Si–C键切割活性损失2.6倍（图3B）。这些结果与Si–C键断裂中酶促氧化的参与一致。随后作者将注意力转向揭示裂解的甲基的命运。作者使用ABTS和purpald比色法，分别检测甲醇和甲醛。结果显示甲醛作为酶促反应的副产物。图3D显示了与羟甘醇4的酶反应时间过程，作者假设有痕量的GC-MS峰是甲酰硅氧烷10(图4)。为了研究这种可能性，作者对羟甘醇4进行了Swern氧化，从而通过1H - 29si异核多键相关(HMBC)和质子核磁共振(1H NMR)原位合成和表征了甲酰基硅氧烷10。随后作者在乙酸乙酯萃取5分钟后，获得了与羟甘醇4酶促反应产生的甲酰硅氧烷10的高分辨率质谱数据。有了这一证据，可以推测初始的硅氧烷1的C-H羟基化之后，第二次氧化为甲酰硅氧烷10，后者转化为硅烷醇5，表面上是通过[1,2]-Brook重排和水解(图4C)。综上所述，硅氧烷甲基的串联氧化解锁了VMS中Si-C键的酶解机制，并作为未来生物降解努力的一个进入途径。
图3
图4
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解锁自然界中未知的退化活动
大量的定向进化文献表明，即使是微量活性也可以被放大，从而产生强大的生物催化剂，用于生物界尚不清楚的转化，包括锻造和破坏Si–C键的酶。本文报道的酶催化的硅氧烷Si–C键的断裂是原理的证明，代表了目前不被认为可生物降解的硅氧烷生物降解的第一步。立法似乎已经限制了VMS的使用，包括作者证明具有活性的八甲基环四硅氧烷。通过改造能够切割Si-C键的酶，作者朝着VMS的最终生物降解迈出了关键一步。